[发明专利]ALDH2基因的检测引物组、其构成的反应体系及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种ALDH2基因的检测引物组、其构成的反应体系及应用。

背景技术

乙醛脱氢酶(aldehydedehydrogenasegene,ALDH)是一类催化人体内乙醛和其他脂肪族醛氧化反应的重要酶类。ALDH家族共有19种同工酶，其中ALDH1-ALDH4为主要常见的4种，其中ALDH1和ALDH2主要在人体肝脏内发挥功能，并且只有ALDH2分布在线粒体中，且编码基因具有遗传多态性。

研究表明，ALDH2具有乙醛脱氢酶和酯酶活性，是人体代谢所摄入乙醇的主要功能酶，同时也是临床药物硝酸甘油的主要代谢酶类。因此，ALDH2编码基因的遗传多态性对于乙醇和硝酸甘油的代谢具有十分重要的影响。ALDH2基因位于人类第12号染色体上，在该基因片段上发现的单核苷酸酸多态性位点(SNP)已有上百个，其中ALDH2*2(Glu504Lys，rs671)可导致ALDH2基因功能缺失并失去酶活性。在人体乙醇代谢过程中，突变型基因ALDH2*2的存在可引起ALDH酶活性的大幅降低，严重阻碍乙醇在体内的代谢进程，导致大量乙醛在人体内蓄积，从而导致肝损伤的出现；因此，CFDA颁布的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》指出“携带ALDH2*2等位基因的心绞痛患者尽可能改用其他急救药物，避免硝酸甘油舌下含服无效。”

另外有研究结果显示，与欧美及其它国家地区人群相比，亚洲人群携带ALDH突变型基因的频率相对较高，约为35％-40％。因此，在亚洲国家和地区开展ALDH基因多态性检测，对于预防乙醇代谢障碍造成的肝损伤以及硝酸甘油的临床用药指导，具有很重要的现实意义。

目前，市场是针对ALDH突变型基因的检测技术手段主要包括基因芯片法、一代测序法、荧光定量PCR法等。其中，基因芯片法技术步骤繁琐，样本处理时间较长，大批量处理操作困难，单次检测成本高，还需要购置额外的检测设备；一代测序法同样存在成本高和操作复杂、检测周期长等不利因素；而荧光定量PCR则存在临床检测假阳性率较高等缺点。CN104894256A公开了一种检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法，其中包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游引物共用的下游引物。然而，从目前来看，这种方法仍然需要通过变温PCR技术，过程复杂，检测耗时长。因此，开发一种成本较低，操作简易且检测效率高，利于临床大范围普及推广的试剂盒，对于ALDH基因多态性检测具有十分重要的意义。

环介导的等温扩增(LAMP)技术是日本科学家于2000年提出的一种等温扩增技术，其主要特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下进行恒温扩增，仅需15-90分钟即可产生10⁹-10¹⁰数量级的产物。具有敏感性高、特异性好、操作简便、成本低廉且结果易于判定的优点。

发明内容

本发明为了克服上述方法的缺陷，提供一种ALDH2基因的检测引物组、其构成的反应体系及应用，所述检测引物组具有敏感性高、特异性好和操作简便等优点。

为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种ALDH2基因的检测引物组，所述检测引物组如下：

正向外侧引物F3：SEQIDNO:1：CGGGAGTTGGGCGAGTAC；

反向外侧引物B3：SEQIDNO:2：AGCAGGTCCTGAACTTCCA；

正向内侧引物FIP：SEQIDNO:3：CAAGCCCCAACAGGCCCTGGGGCTGCAGGCATACAATA；

反向内侧引物BIP：SEQIDNO:4：TCGGAGCCTGCTGGGGGATTGCAGGTCCTGAACCTCTGG。

优选地，所述SEQIDNO:3所示的序列是用于检测ALDH2*2的特异性引物。

本发明中，4条引物的外侧引物记为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3，内侧引物记为正向内侧引物FIP和反向内侧引物BIP，其中FIP包含了F1c和F2，BIP包含了B1c和B2。本发明在普通LAMP的基础上，针对ALDH2*2特异位点设计等位基因特异引物，特异引物位于F2的3’端，同时为进一步加强引物的特异性，在F2的3’端倒数第三位再引进一个突变，进一步降低非特异性扩增的可能性。