[发明专利]一种冷冻保存液及其制备方法和应用

权利要求书

1.氧化石墨烯用于抑制冷冻保存液冷冻和/或复苏过程中冰晶的生长。

优选所述的冷冻和/或复苏过程是生物材料的冷冻和/或复苏；进一步优选所述生物材料选自细菌，真菌，病毒，藻类，立克次体，螺旋体，来源于人体、动物或植物的细胞、组织或器官，以及通过生物工程技术获得的细菌、真菌、病毒、藻类、细胞或组织；进一步优选所述的生物材料选自人体、动物或植物的细胞、组织或器官以及通过生物工程技术获得的细胞或组织；更优选为造血干细胞，软骨组织，肾脏器官，三七的根细胞，皮肤工程组织，哺乳动物或人类的精子。

2.氧化石墨烯在制备冷冻保存液中的应用。

优选所述的冷冻保存液是用于生物材料的冷冻保存；进一步优选所述生物材料选自细菌，真菌，病毒，藻类，立克次体，螺旋体，来源于人体、动物或植物的细胞、组织或器官，以及通过生物工程技术获得的细菌、真菌、病毒、藻类、细胞或组织；进一步优选所述的生物材料选自人体、动物或植物的细胞、组织或器官以及通过生物工程技术获得的细胞或组织；更优选为造血干细胞，软骨组织，肾脏器官，三七的根细胞，皮肤工程组织，哺乳动物或人类的精子。

3.一种冷冻保存的方法，其特征在于，在冷冻保存液中添加氧化石墨烯。

优选所述的冷冻保存方法是生物材料的冷冻保存方法；进一步优选所述生物材料选自细菌，真菌，病毒，藻类，立克次体，螺旋体，来源于人体、动物或植物的细胞、组织或器官，以及通过生物工程技术获得的细菌、真菌、病毒、藻类、细胞或组织；进一步优选所述的生物材料选自人体、动物或植物的细胞、组织或器官以及通过生物工程技术获得的细胞或组织；更优选为造血干细胞，软骨组织，肾脏器官，三七的根细胞，皮肤工程组织，哺乳动物或人类的精子。

4.权利要求1～3任一项所述的应用或方法，其特征在于，所述氧化石墨烯为片状，尺寸为200nm-12μm，优选为200～500nm；层数为1～3层，优选为1～2层；碳氧元素比为1.5～2.2:1，优选约为1.9:1。

优选氧化石墨烯在冷冻保存液中的质量百分比浓度为0.001％～2％，优选为0.01％-1％，进一步优选为0.05～0.5％，更优选为0.08～0.3％，最优选约为0.1％。

5.权利要求1～4任一项所述的应用或方法，其特征在于，所述冷冻保存液含有如下组分：以每升水计，含有0.3～0.7g葡萄糖、7～10g乳糖、0.1～0.5g棉籽糖、0.9～1.3g4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2～5g磷酸盐缓冲对、1～2g氯化钠、2～4g氯化钾、0.01～0.04g硫酸镁、0.05～0.1g氯化钙、0.5～1g酪蛋白，pH值为6.9～7.5。

优选所述的磷酸盐缓冲对组成为：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，磷酸氢二钠和磷酸三钠，磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，磷酸氢二钾和磷酸三钾，或者磷酸氢二铵和磷酸二氢铵。最优选为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，或者磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。

优选pH值为7.1～7.3。

优选，所述冷冻保存液含有如下组分：以每升水计，约0.5g葡萄糖、约9.0g乳糖、约0.3g棉籽糖、约1.1g4-羟乙基哌嗪乙磺酸、约1.2gNaH₂PO₄·2H₂O、约1.6gNa₂HPO₄·2H₂O、约1.5g氯化钠、约3.0g氯化钾、约0.02g硫酸镁、约0.07g氯化钙、约0.6g酪蛋白。

6.权利要求1～5任一项所述的应用或方法，其特征在于，冷冻步骤包括：

(1)将生物材料加入到冷冻保存液中，转移至恒温箱，使得温度降至3～6℃，优选约为5℃，在该温度下维持60～120分钟，优选约90分钟；和

(2)采用程序控温的方式使得保存液体系温度以20～60℃/min的速度降至约-140℃，将降温后的保存液体系置于液氮罐中进行保存；优选以约40℃/min的速度降至约-110℃，再以约20℃/min降至约-140℃。