[发明专利]D-丙氨酸缺陷型筛选表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，具体涉及一种CE酶在枯草芽孢杆菌中的食品级表达，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术

纤维二糖-2-差向异构酶（CE酶）可以催化多种醛糖C2位的差向异构化及异构化反应，是生产稀有糖的良好的生物催化剂，可合成多种碳水化合物。目前，CE酶能催化乳糖进行差向异构化反应生成依匹乳糖，利用单一底物乳糖生产依匹乳糖。

随着由过量高能量食物摄入引发的一系列慢性病在世界范围内的爆发，膳食结构越来越受到人们的关注。新型的蔗糖替代品的开发和研究仍是功能性甜味剂领域具有重要的经济价值的当务之急。依匹乳糖最早是在杀菌后的乳糖溶液中发现的，它是乳糖的异构体。实验证明依匹乳糖不能被小鼠的肠酶消化，B.bifidum、B.longum、B.breve、B.adolescentis、B.catenulatum这些益生菌都能在含依匹乳糖的培养液中增值。证明依匹乳糖具有益生元效果。除此之外，依匹乳糖还能促进钙在小肠内的吸收，增加盲肠壁的重量，提升短链脂肪酸和其他有机酸的含量，降低血浆中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量。由此可知依匹乳糖作为保健食品的原料具有很好的前景。

尽管依匹乳糖能够在高温高压下被化学方法合成，但这会产生很多副产物，因此该化学方法没有实际的应用价值。依匹乳糖还可以由p-硝基苯基半乳糖和甘露糖作为底物，经β-半乳糖苷酶催化合成，但该反应同样有β-1,3和β-1,6副产物出现，而且成本很高。所以用纤维二糖-2-差向异构酶催化得到依匹乳糖是目前生产依匹乳糖最可行的方法。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是芽孢杆菌的一个种，有长期制备发酵食品的历史，是非致病的，且不产生毒素和致热致敏蛋白，被美国食品药物管理局(FDA)和中国农业部等部门批准为食品级安全菌株。Bacillussubtilis表达系统没有明显的密码子偏好性，表达产物不容易形成包涵体，具有很强的蛋白分泌功能，有利于目的蛋白的回收和纯化等后续操作，并且遗传背景研究比较清楚，并具有多年的工业生产技术基础。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，可用于转化乳糖生成依匹乳糖，对依匹乳糖的食品生产具有重要的意义。

按照本发明提供的技术方案，一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌SK40.001(Bacillussubtilis)SK40.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2015582。

所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括敲除枯草芽孢杆菌1A751（MonikaWolf,AttilaGeczi,OrtwinSimon,RainerBorriss;Microbiology1995Vol.141No.2P281-290）染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal，得到宿主D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(dal^-)；将来源于嗜热厌氧杆菌(ThermoanaerobacteriumsaccharolyticumJW/SL-YS485)（ShaoWL,DebloisS,WiegelJ;AppliedandEnvironmentalMicrobiology1995Vol.61NO.3P937-940）的纤维二糖-2-差向异构酶CE基因和P43启动子构建至质粒pUB110（KMKeggins,PSLovett,EJDuvall;PNAS1978Vol.75No.3P1423-1427）中得到pUB-P43-TsCE；用D-丙氨酸消旋酶基因dal代替抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记的可复制质粒pUB-P43-TsCE-dal；并转化枯草芽孢杆菌1A751(dal^-)中表达，得1A751-pUB-P43-TsCE-dal，即获得一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌SK40.001，即CCTCCNO：M2015582。