[发明专利]一种铁皮石斛干细胞的培养方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种铁皮石斛干细胞的培养方法及其应用。本发明铁皮石斛干细胞的培养方法具有分化明显、增殖快并且周期短的优点。制备的铁皮石斛干细胞具有明显的抗氧化和抗衰老活性，可以广泛的应用于药品、化妆品以及保健品领域。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种铁皮石斛干细胞的培养方法及其应用。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科(Orchidaceae)石斛属多年生附生草本植物，又名黑节草。铁皮石斛经烘干加工而成的螺旋状体，称为“铁皮枫斗”。铁皮石斛分布于我国西南和江南各省，多附生于阴湿的树干或岩石缝隙中。由于铁皮石斛自然条件下繁殖率及成活率极低，生长周期长，野生的铁皮石斛已濒临灭绝。

植物干细胞又称为分生组织，是植物生长发育的源泉和信号调控中心。由于植物干细胞是未分化的细胞，因此具有很强的自我更新和持续分裂能力，是拥有永久生存能力的“不朽细胞”；此外，植物干细胞还可以通过自我凋亡防止遗传性损伤，避免将有缺陷的DNA遗传下去，从而保护植物不受恶劣环境的影响。

由植物细胞培养活性物质的生产与从植物直接提取的方法相比具有多种优点，前者不受外部环境的影响，可持续性地生产，因此被认为是可解决生态系统破坏的较佳方法。铁皮石斛干细胞含有较多的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等高活性酶；因此，铁皮石斛干细胞具有较强的抗氧化的作用，是一种纯天然、环保、无污染的抗衰老植物干细胞。

然而，由于植物细胞培养技术在培养期间无法维持稳定的，较快的细胞增殖与高的代谢产物的问题，限制了铁皮石斛抗衰老植物干细胞的应用。为了解决该问题，中国专利申请CN201410486185.1公开了一种铁皮石斛干细胞及其分离培养方法，该方法是从铁皮石斛根尖静止中心的细胞系开始培养，获得稳定遗传的植物干细胞进行培养，该培养方法解决了铁皮石斛离体材料易褐化的问题，由于其干细胞系的细胞尚未分化，具有细胞活性强的优点；但是，静止中心的干细胞具有较长的细胞周期，细胞培养需要较长的时间，不能维持稳定的，较快的细胞增殖，无法满足植物细胞培养技术的产业化生产。因此，研究一种细胞培养周期短，细胞增殖速度快的铁皮石斛细胞培养技术推动植物干细胞的应用是亟需解决的难题。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种铁皮石斛干细胞的培养方法，具体步骤如下：

1)取切除根冠的铁皮石斛根尖，清洗，灭菌消毒；

2)将步骤1得到的铁皮石斛根尖切成5mm小块，接种至筛选培养基上，培养温度为25-29℃，避光培养5-10天，获得形成层来源的铁皮石斛干细胞；

3)将形成层来源的铁皮石斛干细胞转移至液态培养基中培养增殖；

4)将步骤3培养收集的形成层来源的铁皮石斛干细胞移入气升式生物反应器内扩大培养，培养液使用步骤3的液态培养液，在常温下不断搅拌；培养5天后过滤收获铁皮石斛干细胞。

在本发明又一个实施方案中，步骤2)中的筛选培养基中包含以下物质中的一种或多种，所述物质选自，包括但不限于，甲基茉莉酮酸酯、真菌提取物、细菌提取物、酵母提取物、壳聚糖、葡甘露聚糖、葡聚糖、苯丙氨酸、苯甲酸、水杨酸、花生四烯酸、马尿酸、硝酸铯铵、硫酸锌、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、柠檬酸、甘氨酸、α-萘乙酸、蔗糖、活性炭、AgNO₃、硫酸氧钒、p-氨基苯甲酸、N-苯基–N’-1,2,3-噻二唑-5-脲(TDZ)、油菜素、类固醇、三十烷醇、藻酸钠和/或醋酸钠。在优选的实施方案中，所述筛选培养基为含有0.01-0.5mg/L的6-BA、0.01-0.8mg/L的TDZ和0.01-0.8mg/L的三十烷醇的B5培养基。在更进一步地实施方案中，所述筛选培养基为含有0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的TDZ和0.05mg/L的三十烷醇的B5培养基，pH值为6.7。