[发明专利]一种用于大肠杆菌基因敲入的负筛选标记

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种重组工程方法将待目的基因敲入至大肠杆菌基因组的负筛选标记。

背景技术

基因表达是现代生物学的一个重要手段，是获得治疗性药物蛋白和催化用酶等应用领域的必需手段。在基础研究领域，基因表达也是研究基因和蛋白的功能和研究生物体代谢和调控等必不可少的策略。常规的基因表达常常是将目的基因克隆在质粒上再转化至宿主菌(最常见的是大肠杆菌)，质粒以游离于菌体染色体的形式进行复制，一般常在诱导之下基因表达。虽然基于质粒的表达最为常见，但基于染色体的基因表达呈现出一些独特的优点，如无需抗生素的压力以维持质粒的存在，可同时进行多个基因的表达而避免选择质粒和克隆至质粒的困难。在某些情况之下，由于目的基因的毒性而不能克隆在常为多拷贝的质粒之上，而基于染色体的表达由于是单拷贝的形式，可以避免毒性的问题。

将基因敲入至大肠杆菌基因组常常采用正筛选标记和负筛选标记相结合的方法。正筛选标记为抗生素抗性基因。目前所采用的负筛选标记有着诸多的缺点，遗传学中最常用的负筛选标记为sacB基因。sacB基因编码的蔗糖6-果糖基转移酶催化蔗糖而生成对菌株有毒性的聚蔗糖，故含有sacB的菌株不能生存。但sacB较大(1.7kb)，sacB和抗生素抗性基因组成基因盒后，一般在2.5kb以上，难以进行PCR扩增或难以获得足够的量用于转化实验，且当此基因盒整合至基因组之后，对所得菌株进行基因型分析也难以扩增出全长进行分析，而只能设计针对sacB或抗性基因的引物进行基因型分析。另外，常有高达10％的细胞对sacB基因产物表现出随机的抗性，即为背景克隆。这些不足均制约了sacB基因作为负筛选标记的使用。其他的一些负筛选标记，如thyA、galK、rpsL、upp和pryF等，需要首先对宿主菌进行突变得到突变株，再以此突变菌株出发进行基因敲入，这样一方面增加了工作量，又有着遗传操作的限制，且常常需要额外添加某些生长元素以维持突变菌株的生存。鉴于此，开发简便、实用和高效率的负筛选标记具重要意义。

发明内容

为开发适用简洁和高效的负筛选标记用于大肠杆菌基因组的敲入，从而为目的基因基于染色体的表达提供平台以及为研究基因和蛋白的功能奠定基础。

本发明公开了plac启动子驱动的毒性基因ccdB作为大肠杆菌基因敲入的负筛选标记的应用。

本发明提供了一种新型的负筛选标记，即plac启动子驱动的毒性基因ccdB。本发明所涉及的基因敲除的方法，包括如下两个关键的步骤：

(1)第一步是自含plac-ccdB-aacC1模板质粒pLS3161扩增含有同源臂的线性DNA片段，电转化至表达重组酶的大肠杆菌。在庆大霉素筛选之下，重组酶催化同源臂之间的同源重组而将此DNA片段整合至大肠杆菌基因组。

(2)第二步是利用相同的同源臂扩增目的DNA片段，将目的DNA片段电转化表达重组酶的第一步所得菌株，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的筛选之下，ccdB表达，其毒性作为负筛选标记的特征，重组酶催化同源臂之间的同源重组，外源DNA片段取代plac-ccdB-aacC1基因盒而实现基因敲入。

本发明所使用的、包含plac-ccdB-aacC1基因盒的模板质粒pLS3161是由如下方法获得：以pMK2010为模板，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2为引物PCR扩增得到363bp的plac的3'端和ccdB基因，以之为模板，SEQIDNO.3和和SEQIDNO.2为引物PCR扩增得到414bp完整的plac和ccdB基因。以pBAD322G为模板，SEQIDNO.4和SEQIDNO.5为引物PCR扩增得到757bp的aacC1。414bp的plac-ccdB片段和757bp的aacC1片段均以XhoI酶切，两个片段和pKD4以T4DNA聚合酶处理所得的钝端载体以T4DNA连接酶进行连接。连接产物转化含有pir基因和gyrA462突变基因型的大肠杆菌宿主菌DB3.1λpir的感受态细胞，在50μg/ml的氨苄青霉素和25μg/ml的庆大霉素抗性筛选之下得到重组克隆。重组克隆以酶切和测序进行验证得到pLS3161。