[发明专利]一种Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种Tat PTD‑Endostatin‑RGD重组蛋白，是由人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域、人内皮抑素以及来自纤维细胞附着域的RGD三肽构成。本发明还公开了该Tat PTD‑Endostatin‑RGD重组蛋白的制备方法，以及在制备治疗由新生血管生成引起的疾病的治疗药物中的应用和在在制备抑制内皮细胞迁移的药物中的应用。本发明的Tat PTD‑Endostatin‑RGD重组蛋白保留了内皮抑素抑制新生血管增生的活性，能够穿过血脑屏障或眼球屏障与新生血管处过表达的整合素特异性结合，融合蛋白的靶向性和停留时间得到了极大的提高。

技术领域

本发明涉及一种Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白及其制备方法与应用，属于生物药物技术领域。

背景技术

内皮抑素(Endostatin，Es)是O′Reilly等人1997年从血管内皮瘤中分离出来的一种内源性血管生成抑制剂。内皮抑素是胶原蛋白XVIII分子C末端的片段，共有184个氨基酸残基，分子量为20kDa。研究证明内皮抑素只能抑制新生血管的生成而不对已存在的血管发生作用。内皮抑素是目前作用最强、实验效果最好的肿瘤血管生成抑制剂，近年来倍受关注，目前在美国已经进行I期和II期临床试验，在我国已将血管内皮抑素衍生物研制成具有国家自主知识产权的一类新药Endostar(恩度)，用以治疗非小细胞肺癌。但是，内皮抑素仍旧存在一些缺点，例如其入胞能力差、稳定性差、半衰期短等，限制了其在临床上的应用。

申请人在前期的研究中已经成功开发了一种Tat PTD-Es重组蛋白，其中，Tat PTD是人类免疫缺陷病毒HIV-1的反式激活因子的转导域，其氨基酸序列为YGRKKRRQRRR，研究表明将其与Es通过基因工程的方法重组表达出来的蛋白质可以穿透眼球屏障到达眼底，增加了Es的入胞能力(专利“一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用”，专利申请号2012101492019)。但申请人在继续研究的过程中发现，重组蛋白Tat PTD-Es对眼底视网膜内皮细胞的靶向性和停留时间仍有待进一步的提高。

整合素为细胞黏附因子家族的重要成员之一，主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(ECM)之间的相互粘附，并介导细胞与ECM之间的双向信号传导。整合素是由α和β两个亚单位形成的异二聚体，表达于血管内皮细胞的有腔面和无腔面，介导内皮细胞的迁移和毛细血管腔的形成，其中α_vβ₃和α_vβ₅整合素的作用尤为重要。正常情况下，在静息期血管内皮细胞表面α_vβ₃整合素有低水平表达，在细胞因子和生长因子的刺激下，其表达上升。研究表明，整合素在新生血管内皮细胞中有高表达，对新生血管的生成起着重要作用，其中，其中α_vβ₃尤为重要。因此，整合素α_vβ₃会成为一些抗血管生成药物的作用靶点。含有精氨酸-甘氨酸-天冬酰胺序列的多肽RGD可以特异性识别整合素α_vβ₃。RGD存在于多种细胞外基质中，可以与11种整合素特异性结合，能有效促进对细胞的附着。

但由于将不同活性的目的蛋白组合在一起进行融合表达尚存在一系列技术上的难点，例如不同蛋白整合后是否还能具有原有的活性，融合蛋白表达体系的选择等，因此，目前还没有关于将Tat PTD、Endostatin和RGD三者进行融合表达的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白及其制备方法与应用。利用Tat PTD的穿膜作用、Es的抑制新生血管生成的作用以及RGD三肽能够与整合素特异性结合的特性，将三者通过基因工程的方法融合表达，获得了一种能够穿过血脑屏障或者眼球屏障的并能在新生血管表面发挥药效的内皮抑素，达到通过局部滴眼的给药方式预防眼底新生血管疾病的目的。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：