[发明专利]一种中温碱性脂酶及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种具有新基因序列的中温碱性酯酶、其制备方法及应用。

背景技术

酯酶，是指对于酯键的形成与水解起到催化作用的一类酶，广泛存在于植物、动物和微生物里。酯酶在催化过程中可以与很多底物发生合成或水解的反应，在该反应过程中并不需要其它辅助因子参与反应的进行，催化反应能够在有机相的反应环境中保持较高的反应稳定性，除此之外，酯酶发生的催化反应具有极强的区域专一性和立体特异性，具备工业用酶所要求的优点。因此酯酶在工业诸多领域中被广泛使用，也在全球范围酶制剂市场中占有很大的比例。研究并开发出具有优良性能的新型酯酶不仅有利于降低相应的工业生产成本，也对提高食品安全，降低油脂等化工业污染能耗，减少环境污染及维持可持续发展，提高药物制剂的使用安全性等方面，都具有重要意义。

海洋环境具有极高的多样性，寒流、热液喷口、深海平原、海沟、海山、海底火山、深海鲸骸等连同不同的压力、盐度、温度、营养组成和光照条件为海洋微生物的多样性创造了条件。然而，目前仅有0.1％左右的海洋微生物能够被分离纯培养利用。针对海洋微生物分离纯培养方面的问题，利用宏基因组技术开发新型功能基因以及具有特殊用途的酶蛋白，在当今开发利用新型工业用酶方面有着非常广阔的前景。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新的酯酶基因est424。

本发明的第二个目的是提供一种由所述酯酶基因est424编码的重组酯酶est424。

本发明的第三个目的是提供一种所述酯酶est424的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

酯酶基因est424的序列如下：

所述酯酶基因est424编码的酯酶est424的氨基酸序列如下：

所述可溶性酯酶est424的制备方法包括以下步骤：

1)克隆酯酶基因est424；

2)将酯酶基因est424插入表达载体，构建携带所述酯酶基因est424的重组表达载体；

3)将重组表达载体与伴侣蛋白质粒pKJE7共转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞中；

4)选取转化后大肠杆菌BL21(DE3)中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；

5)离心后收集发酵后的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，并重悬于裂解缓冲液中进行裂解；

6)将步骤5)中裂解的悬液离心，收集上清液，用镍离子螯合树脂进行亲和纯化，再使用脱盐柱脱盐，即得所述可溶性酯酶est424。

在步骤2)中，所述表达载体为pET28。

在步骤4)中所述培养基为含有100μg/mL卡那霉素和20μg/mL氯霉素的LB培养基，所述发酵条件为：温度37℃，摇床培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mmol/L，在16℃条件下培养24小时。

在步骤6)中，所述离心为12000g，离心30min，4℃。

一种中温碱性脂酶基因的应用，所述中温碱性脂酶基因在催化酯类及衍生物底物的水解反应中的应用。

该酯酶最适反应温度为35℃，最适反应pH值为8.0，酶活单位为171.03U/mg。

一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列的功能片段。

一种重组细胞，该宿主菌包含有SEQIDNO.2的中温碱性脂酶基因编码的蛋白。

本发明所具有的优点：

1)本发明从南海深海沉积物宏基因组文库中得到一个新的酯酶的DNA序列，其通过基因工程技术对其功能进行研究，发现将重组表达载体与伴侣蛋白质粒pKJE7共转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，可获得高效可溶表达，经蛋白纯化及SDS-PAGE电泳，得到一条单一的蛋白条带，分子量为35kDa。

2)本发明中酯酶的酶学性质如下：

最适反应温度为35℃，最适反应pH值为8.0，该酯酶是一个中温碱性酯酶，其酶活单位为171.03U/mg。它在20℃下稳定，Fe²⁺和Mn²⁺可以有效提高酶的活性，1％的Tween80和20也可以提高酯酶的活性。

附图说明

图1为本发明实施例提供的纯化后的酯酶est424SDS-PAGE电泳结果。