[发明专利]一种蛇足石杉无菌苗的快速繁育方法

权利要求书

1.一种蛇足石杉无菌苗的快速繁育方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

（1）芽胞的采集与处理：采集饱满、无病虫害的蛇足石杉的芽胞，流水冲洗0.5-1小时，然后于4℃条件下低温保湿保存与处理3-4周；

（2）外植体表面消毒：将经低温保湿保存处理的芽胞于超净工作台中，无菌水清洗2-3遍，无菌纸吸干表面水分；然后浸泡于70%乙醇中30-60秒，无菌水清洗3-5遍；最后置于5%的次氯酸钠溶液中消毒8-10分钟，无菌水清洗3-5遍；

（3）内生菌杀灭培养与芽胞萌发：经表面灭菌的外植体转移至添加苯菌灵可湿粉DW50的改良Moore’s液体培养基中，于20-23℃、光照强度500-1000lx、光照时间12-14h/d条件下培养3-4周；

（4）幼苗的继代与增殖：将已灭菌的外植体转至以苔藓为基质，添加改良Moore’s培养液以及0.015-0.045mg/lIBA，0.3-0.9mg/lKT，0.25-0.75mg/lNAA的植物激素组合体系中，于20-23℃、光照时间12-14h/d、相对湿度70-90%、光照强度1000-3000lx条件下培养，每两个月更换一次培养基；

（5）试管苗的驯化培养：将种植基质先用苯菌灵稀溶液灭菌，再在阳光下暴晒处理8h；取继代增殖培养2次的试管苗开瓶盖驯化一周后，洗净根部培养液，移植到经消毒灭菌处理过的种植基质上，大棚培养1-2个月，即可获得驯化苗，以备大田移栽。

2.根据权利要求1所述一种蛇足石杉无菌苗的快速繁殖方法，其特征在于所述芽胞处理是于4℃冰箱中低温保湿保存与处理3-4周。

3.根据权利要求1所述一种蛇足石杉无菌苗的快速繁殖方法，其特征在于所述芽胞内生菌杀灭与萌发是在添加2-3g/l苯菌灵可湿粉DW50的改良Moore’s液体培养基中进行。

4.根据权利要求1所述一种蛇足石杉无菌苗的快速繁殖方法，其特征在于所述的幼苗继代与增殖的培养基为以苔藓为基质，并添加了改良的Moore’s培养液以及0.015-0.045mg/lIBA、0.3-0.9mg/lKT和0.25-0.75mg/lNAA。

5.根据权利要求1或4所述一种蛇足石杉无菌苗的快速繁殖方法，其特征在于所述的改良Moore’s培养液由50mg/L硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、25mg/L氯化钙(CaCl₂·2H₂O)、50mg/L磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、50mg/L氯化铵（NH₄Cl）、5.56mg/L硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)、9.31mg/L乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA·2H₂O)、0.415mg/L碘化钾(KI)、0.125mg/L钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)、0.012mg/L硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)、0.012mg/L氯化钴(CoCl₂·6H₂O)、11.15mg/L硫酸锰(MnSO₄·H₂O)、4.3mg/L硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)和20g/L蔗糖组成；所述改良Moore’s培养液高压灭菌前的pH值为5.6，培养液与苔藓基质灭菌条件为121℃、104kPa下灭菌20min。

6.根据权利要求1所述一种蛇足石杉无菌苗的快速繁殖方法，其特征在于所述试管苗的驯化培养所使用的种植基质的组成为原生土:腐殖土:木屑:菌渣=1:3:3:3；大棚培养条件为：遮阳度60～90﹪，温度控制在20-30℃、相对湿度控制在70-90%。