[发明专利]一种小鼠组织中结核杆菌DNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于DNA提取技术领域，尤其涉及一种小鼠组织中结核杆菌DNA的提取方法。

背景技术

结核标准菌珠H37Rv感染小鼠后，要得到小鼠体内(如肺组织)中结核杆菌的载量，通过提取其模板DNA，用绝对定量方法得出组织中结核杆菌的拷贝数(copynumber)与组织DNA拷贝数比值。因此，要得到上述结果，必须提取组织总DNA(含小鼠组织DNA和结核杆菌DNA)。目前所知的方法有肺泡灌洗液提取和制作组织石腊切片用二甲苯、丙酮提取法和试剂盒提取法。组织石腊切片用二甲苯、丙酮提取法操作繁琐，DNA的提取率较低；试剂盒提取法：采用市场上购买得到的DNA提取试剂盒，能够进行组织溶解和细胞裂解后提取DNA，虽然该方法操作简便，但是DNA的提取率较低。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种小鼠组织中结核杆菌DNA的提取方法。所述提取方法DNA的提取率高、操作简便。

本发明的技术方案如下：一种小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，包括以下步骤：

步骤(1)将小鼠肺组织匀浆离心后弃上清，加入GA缓冲液和蛋白酶K溶液后，50～56℃水浴3～12h，进行组织溶解得到细胞悬液；

步骤(2)细胞悬液中加入pH为8的TES缓冲液和5％的SDS溶液后，先置于温水浴中40min，再置于沸水浴60min，最后在冰上放置5min，得到混悬液；

步骤(3)在混悬液中加入pH4.8的醋酸钠溶液和0.05mol/L的葡萄糖溶液，冰上放置10～20min；然后加入苯酚/氯仿/异戊醇溶液提取，离心后取上层水相，上层水相中加入氯仿/异戊醇溶液提取，离心后，取上层水相，加入乙醇，充分震荡后，－20℃沉淀30min，离心得到沉淀物，沉淀物即为总DNA，总DNA包括小鼠DNA和结核杆菌DNA，总DNA进行QPCR扩增得到小鼠肺组织中结核杆菌DNA的载量。

步骤(1)所述GA缓冲液、蛋白酶K溶液来源于细菌基因组DNA提取试剂盒,蛋白酶K溶液的浓度为2mg/ml，GA缓冲液用于悬浮细胞，并为蛋白酶K提供适合的反应体系。

TES缓冲液用于裂解细菌的细胞壁，释放DNA，其中含有Tris-HCl、EDTA、SDS和溶菌酶，溶菌酶的浓度为20mg/mL；SDS是一种蛋白变性剂，破坏蛋白质的高级结构。

步骤(2)所述温水浴的温度为36～37℃，溶菌酶在该温度范围下活性最高，从而裂解小鼠肺组织中结核杆菌细胞壁。

步骤(2)沸水浴的目的有两个：第一，在裂解细胞的工作完成后，为了避免溶菌酶继续反应，产生高温使得溶菌酶失活。第二，沸水浴条件下，也可使溶菌酶裂解不充分的结核杆菌细胞壁得到进一步破碎，从而进一步提高DNA得率。

步骤(3)所述苯酚/氯仿/异戊醇溶液中苯酚、氯仿和异戊醇体积比为25：24：1，所述氯仿/异戊醇溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。

作为优选，本发明提供的方法中所述离心条件为12000r/min,离心10min。

作为优选，步骤(3)加入乙醇充分震荡后，在低温条件下可使得DNA更容易沉淀，且可保护DNA不被降解。

提取总DNA后进行QPCR扩增，然后进行琼脂糠凝胶电泳。

QPCR扩增时本发明根据结核杆菌特有基因设计特有的引物序列；QPCR(实时荧光定量PCR)扩增采用的引物序列如下：

前引物：5’－AGAAGGCGTACTCGACCTGA－3’

后引物：5’－CTGAACCGGATCGATGTGTA－3’。

QPCR扩增条件为：94℃预变性3s，94℃变性1min，52℃退火30s，72℃末次延伸30s，变性与退火循环35次。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的提取方法提取率高、操作简便，得到的DNA的纯度和浓度均较高。

附图说明

图1为提取不同感染时间的小鼠肺组织DNA后进行QPCR扩增后的电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。

GA缓冲液和蛋白酶K溶液来源于细菌基因组DNA提取试剂盒，该细菌基因组DNA提取试剂盒购买于天根生化科技有限公司，目录号为DP302-02；PCR试剂盒购买于TaKaRa公司；本发明根据结核杆菌特有基因X52471设计引物序列，由上海生工科技公司合成；所述的小鼠为结核标准菌珠H37Rv感染的km小鼠(雌)。

实施例1

小鼠肺组织(80mg)