[发明专利]一种结核杆菌DNA的提取纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及结核杆菌技术领域，具体为结核杆菌的DNA提取纯化方法。

背景技术

肺结核病是由结核杆菌引起的一种人畜共患的慢性传染病，是目前单一传染性细菌致人死亡的主要因素。近年来，随着艾滋病的流行、多种恶性肿瘤患者的增多以及多重抗药性菌株的出现，更是增加了结核菌感染症防治上的困难。统计数据显示，全世界有结核病菌感染者20亿(占总人口1/3)，每秒钟感染一人，全球结核病菌每年新感染800万人，如果不立即采取防扩散措施，结核病将在今后10年内夺去3000多万人的生命。我国全国结核病感染者3.3亿，结核病人600万，每年因结核病死亡的病人高达25万，为各类传染病死亡总和的两倍，因此我国已将结核病由丙类传染病升为乙类传染病，列入严格管理范畴。据WHO统计，全世界每年有5千万至一亿人感染结核，约三百万人死于结核病，其中80％以上在发展中国家。因此，如何快速尽早地诊断并治疗成为控制结核病扩散和传播的关键环节。

众所周知，要想对DNA进行鉴定，必须得到足量且纯净的DNA样本，DNA提取纯化技术是医学DNA检验的第一个步骤，也是最关键的步骤。这些生物检材中除了DNA外还包括许多物质，在分析DNA之前，必须将DNA同其他物质分离开来。可以说，能否成功进行DNA检验取决于能否从生物检材中获得高质量DNA。传统的DNA提取法有CHELEX提取法：该方法虽然提取DNA量较多，但对微量、污染的检材效果欠佳。而且该方法提取的DNA中常存在PCR扩增抑制物，且不宜长期保存，这些都可能使扩增效率下降或扩增失败。由此看到，虽然这些方法可以提取出较多的DNA样本，但是由于提取纯度较低，含有较多PCR抑制物，影响了接下来的扩增过程，这样也就影响了DNA的检验。提取结核杆菌DNA的最大难点是如何破其牢固的细胞壁，一般细菌用细胞裂解液即可使其破壁，但对于提取结核杆菌DNA，细胞裂解液不能有效破壁。所以如何能提取出较纯净的结核杆菌DNA显得十分的必要。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种能够提取高纯度的结核杆菌DNA的方法，包含以下步骤：

一种结核杆菌DNA的提取纯化方法，包括以下步骤：

(1)取结核杆菌的细菌悬液于试管中；

(2)用pH值8.0的0.01MEDTA洗涤细菌，离心后沉淀，弃上清液；

(3)向步骤(2)的沉淀中加入pH值为8.0的TES，5％(W/V)SDS，于35～40℃下溶解30～60min后沸水浴30～60min，再于冰上放置3～7min；

(4)向步骤(3)的产物中加入pH值4.8的NaAc和浓度为0.05mol/l的葡萄糖，颠倒混匀后冰上放置3～7min；

(5)向步骤(4)获得的试液中加入苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀后于离心处理后沉淀，取上层水相；

(6)向步骤(5)中的上层水相中加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)，颠倒混匀并离心处理后沉淀，取上层水相；

(7)向步骤(6)中的上层水相中加入无水乙醇，充分震荡后离心处理后，在－5～－30℃下沉淀20～40min；

(8)取步骤(7)的沉淀物，晾干3-5分钟，加入TE缓冲液，得到结核杆菌DNA溶液。

优选的，所述步骤(3)中的TES中含有浓度为18～23mg/ml溶菌酶。

优选的，所述的离心处理的条件为12000r/min的10min离心。

优选的，所述步骤(3)中处理条件为：于37℃下溶解40min后沸水浴40min，再于冰上放置5min；

优选的，所述步骤(7)中处理条件为在－20℃下沉淀30min。在低温条件下可使得DNA更容易沉淀，且可保护DNA不被降解。

由于结核菌细胞壁坚固，常规方法难以有效破除。导致结核菌DNA难以溢出菌体，故很大程度上影响DNA提取得率。本发明利用溶菌酶是一种能水解致病菌细胞壁的碱性酶，且该酶的最适工作温度为摄氏37度，故将高浓度溶菌酶溶解至TES缓冲液中，配成结核菌细胞壁裂解液，并且使该酶处于约37℃的最适温度范围下，水浴约40分钟左右，使其充分反应，从而裂解结核菌细胞壁，沸水浴的目的有两个：第一，在裂解细胞壁的工作完成后，为了避免溶菌酶继续反应，溶解其他可能接触到的细菌，造成杂类DNA污染，因此我们用沸水浴，产生高温使得溶菌酶失活。第二，沸水浴条件下，也可使溶菌酶裂解不充分的结核菌细胞壁得到进一步破碎，从而进一步提高DNA得率。因此，上述方法目的即在于充分破碎结核菌细胞壁，得到的结核杆菌DNA的纯度和浓度较高，提取效率高。