[发明专利]一种快速鉴定实蝇种类的特异性引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速鉴定实蝇种类的特异性引物及其应用。

背景技术

实蝇属于双翅目(Diptera)实蝇科(Tephritidae)，全世界广泛分布，多发生在热带和亚热带地区，约有500属4500种。150余种实蝇具有严重的经济危害性，以卵和幼虫或蛹随寄主果实、包装物和运输工具等远距离人为传播扩散，危害果树和蔬菜等经济植物，倍受各国植检和农业部门的关注。

实蝇的种类鉴定主要依据成虫的形态学特征，虽具有快速、简便和成本低的特点，但同时也存在一些局限性。特别是在区分实蝇近似种方面，要求标本具有完整的形态结构，并需要鉴定人员具有丰富的分类经验和技能。此外，对于实蝇幼虫的种类鉴定相当困难，且在多数情况下不可能实现，但在我国口岸截获的多为实蝇的卵和幼虫，将幼虫饲养到成虫再进行种类鉴定需要较长时间，直接影响到口岸检疫的运行速度和检疫质量。

DNA条形码技术是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行物种鉴定的技术。2003年，加拿大圭尔夫大学的分类学家PaulHebert等通过对动物界，包括脊椎动物和无脊椎动物11门13320个物种的COI基因的比较分析得出：除腔肠动物Cnidaria外，98％的物种的COI序列差异在种内小于2％，种间平均达到11.3％。据此，Hebert提出用位于线粒体COI基因5’端58-705区域长度为648bp的片段作为条形编码的基因，为全球生物编码。目前，线粒体DNA已成为动物DNA条形码研究的首选对象，已有很多成功使用COI基因的报道。迄今为止，COI基因被证明适用于包括腹足类(gastropods)、弹尾目(springtails)、蝴蝶、鸟类、蜉蝣类、蜘蛛、甲壳动物(Crustacea)以及最近研究的硅藻类(diatomea)和原生动物(Protista)的分类鉴定。尤其在昆虫种类的鉴定上，相对于传统的形态学方法，DNA条形码具有对昆虫各生命阶段(非成虫态和成虫态)和形态结构保存不完整的昆虫标本进行准确的物种鉴定这一明显优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鉴定实蝇种类的特异性引物，该引物能够快速准确的对截获的不同形态(幼虫、卵、蛹，以及头、胸、翅、腹、足等)的疑似实蝇进行甄别，以此实现对不同来源、不同地区、不同种类实蝇的鉴别。

本发明具体通过以下技术方案进实现：

一种快速鉴定实蝇种类的特异性引物，包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明所述的特异性引物用于在鉴定实蝇种类试剂盒中的应用，所述的试剂盒包括：灭菌四蒸水H₂O，31μl；10³Buffer，5μl；25mmol/lMg²⁺，4μl；25mmol/ldntp，1.5μl；上述引物各4μl；5U/μlTagDNA聚合酶，2U；含20～50ng的DNA模板2μl。

本发明还提供了一种用于快速鉴定实蝇种群的方法，包括以下步骤：

1)设计，合成上述引物对；

2)提取被鉴定生物体的DNA，以所述被鉴定生物体的DNA为模板，进行PCR扩增；

3)产物测序，测序后得到的每个种群的独享单倍型就是该种群的特征单倍型序列，能鉴别不同种群的实蝇。

所述的扩增体系为：每一样品的体积为50μl，其中灭菌四蒸水H₂O，31μl；10³Buffer，5μl；25mmol/lMg²⁺，4μl；25mmol/ldntp，1.5μl；上述引物各4μl；5U/μlTagDNA聚合酶，2U；含20～50ng的DNA模板2μl。

所述的扩增条件为：35个循环，包括94℃，20s；55℃，0s；72℃，1min。

本发明的有益效果为：发明引物能有效扩增实蝇类害虫线粒体上COⅠ基因长度约600bp的片段，扩增效率高，效果好，引物稳定，能有效区分实蝇不同类群及种群间的差异，有利于实蝇的种群、种类鉴别，鉴定。已在桔小实蝇，南瓜实蝇，瓜实蝇和番石榴实蝇，具条实蝇等多个实蝇类群上得到广泛应用。

附图说明

图1是桔小实蝇总DNA的PCR扩增产物电泳图；

图2是扩增不同形态实蝇的DNA产物电泳；1腿部，2头部，3胸部，4腹部，5完整成虫。