[发明专利]海洋生物源多肽的高效液相色谱和凝胶渗透色谱分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种海洋生物活性多肽的分离纯化方法，尤其涉及海洋生物源多肽的高效液相色谱和凝胶渗透色谱分离纯化方法。

背景技术

单环刺螠(Urechisunicinctus)，俗名海肠、海肠子，属于螠虫动物门、螠纲、无管螠目、刺螠科。体粗大，长约100-300mm，宽约25-27mm，长200mm-250mm，体表满布大小不等的粒状突起，吻圆锥形；腹刚毛1对，粗大；肛门周围有一圈9-13条褐色尾刚毛。分布于俄罗斯、日本、朝鲜和我国黄渤海沿岸，是我国北方沿海泥沙岸潮间带下区及潮下带浅水区底栖生物的常见种。它个体肥大,肉味鲜美,体壁肌富含蛋白质和多种人体必需氨基酸。自古以来,在我国、日本和朝鲜沿海均作为名贵的海鲜食品,有较高的经济价值。人们的传统做法只食用其体壁，而废弃内脏，菜肴俗称海肠子。

单环刺螠提取的多肽有一定的抗肿瘤及提高小鼠免疫功能的作用,肿瘤的发生是多种原因作用的结果，但最终都要涉及到癌基因的表达调控。不同的肿瘤产生时所需要的酶等调控因子不同，选择特异性小肽作小于肿瘤发生时所需的调控因子等，封闭其活性位点，可防止肿瘤发生。现在已发现很多肿瘤相关基因及肿瘤产生调控因子，筛选与这些靶点特异结合的多肽，已成为寻找抗癌药物的新热点，值得一提的是，传统的抗肿瘤药物由于缺乏对癌细胞的选择性，往往在治疗的同时产生不良反应。抗肿瘤活性多肽与此不同，在杀伤肿瘤细胞的同时对免疫系统起保护作用。已有实验证明单环刺螠多肽在体外抑制人肝癌细胞生长,并可以增强小鼠免疫力,抑制小鼠S180肉瘤的生长。但由于近几年由于捕捞强度过大，野生资源已显不足。现今，我国也陆续开展了单环刺螠人工培育苗种的生产性研究。本发明专利涉及到对单环刺螠内脏进行酶解获得降压活性多肽，为单环刺螠多肽类活性物质的开发提供重要参考。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状提供一种具有较好的ACE抑制活性的、源自单环刺螠的采用高效液相色谱制备的活性多肽的制备方法。

该采用高效液相色谱制备的活性多肽的制备方法如下：

1）选取单环刺螠内脏，破碎处理后，用丙酮脱脂过夜，离心弃去上清，沉淀在35℃至40℃下干燥后粉碎后得到单环刺螠内脏粉；

2）取步骤1）所述的单环刺螠内脏粉按比例加入蒸馏水，于80℃的恒温水浴锅内加热4h后，离心取上清液，得到的上清液浓缩后为样品；

3）取步骤2）所述的样品按比例加入蒸馏水，然后调节pH6.8，加入木瓜蛋白酶，在60℃水浴中加热，后用100℃水浴加热10min至15min灭酶，在离心机中4500rpm离心20min后取上清液，将该上清液采用胰蛋白酶水解2-4h，控制提取温度为60℃，pH：10；

4）步骤3）提取完成后调pH至中性后100℃水浴加热10至15min灭酶，以4500~6000rpm离心后取上清液；

5）将步骤4）处理得到的上清液浓缩后，使用95%乙醇沉淀，使乙醇终浓度约为70%~80%，于4℃静置5h至20h，然后将上清液浓缩冷冻干燥得到单环刺螠蛋白酶解产物；

6）生物活性肽的分离纯化：将所述的单环刺螠蛋白酶解产物采用SephadexG-15凝胶色谱柱层析，高效液相色谱分离纯化得到Gln-Pro-Met-Thr-Phe。

SephadexG-15凝胶色谱柱层析含有如下步骤：

取所述的单环刺螠蛋白酶解产物，用蒸馏水溶解成100mg/ml溶液，SephadexG-15凝胶色谱柱2.0cm×100cm进行分离纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5ml/min，收集各峰。

高效液相色谱的分离纯化具有如下步骤：

用高效液相色谱进一步分离纯化。色谱条件如下：色谱柱采用规格为250mm×4.6mm,5μm的反相C18键合硅胶柱；流动相：A水，B乙腈；收集主要色谱峰，冻干备用得到Gln-Pro-Met-Thr-Phe。

步骤2）所述的比例为质量比1：10至1：50或质量体积比50g：500mL至50g：2500mL。

步骤3）所述的比例为质量比1：1至1：5或质量体积比50g：50mL至50g：2500mL。

步骤3）所述的木瓜蛋白酶占样品溶液质量分数的2%。

与现有技术相比，本发明的优点在于：提取、纯化工艺较先进、快速、准确度高，制得的多肽ACE抑制活性显著。

附图说明