[发明专利]流式液相芯片急性高原病脯氨酰羟化酶基因rs480902位点检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及人类基因诊断试剂盒，采用流式荧光杂交法定性检测急性高原病易感基因中的SNP位点。适用于临床急性高原病易感基因的预测诊断，还可用于高原适应人群和AMS患者基因组检测。

背景技术

青藏高原地域辽阔、物产丰富，蕴含着巨大的经济发展潜力；青藏高原地处祖国西南边睡，是重要的天然屏障，军事地理位置重要。但高原自然生存环境恶劣，在海拔3000米高原，大气压降至537mmHg，仅为海平面的70%，大气氧分压为103mmHg，肺泡气氧分压为62mmHg，高原缺氧导致机体劳动能力明显降低，在海拔4500米地区，人的体力只有平原的60%。高原特殊的环境因素可导致高原病的发生，急性高原病(AcutemountainsieknessAMS)最为常见，危害也最大。流行病学调查显示，AMS多发生于海拔2500米以上的高原，而我国海拔3000米以上的高原就占国土面积的1/6，常住人口约6000多万。目前AMS已经成为我国高原地区的重大公共卫生问题，严重阻碍着当地经济、社会及各项事业的发展。由于AMS发展迅速，后果严重，目前又缺乏非常有效的治疗措施，因此，寻找有效的预防措施显得尤为迫切。AMS是一种多基因疾病，是高原低氧的环境因素和许多微效致病基因共同作用的结果。大量研究表明，诱导AMS形成的易感基因产物在AMS患者和高原习服人群之间的表达存在显著性差异。如果在进入高原之前，通过遗传标记的检测，将携带这种易感基因型的个体筛检出来，避免其暴露于高原低氧环境，就能有效预防AMS的发生。但现有的实验室检测方法均不能进行易感基因型检测。总之，研发急性高原病易感基因的预测诊断试剂盒仍然是人们面对的挑战之一。

流式液相芯片技术又称流式荧光技术或悬浮阵列流式荧光技术，其原理是将荧光标记后的单细胞（或颗粒）悬液随鞘液进入流动室，压力迫使鞘液包裹的液滴包含单一细胞或颗粒垂直通过检测区。荧光标记的细胞或颗粒在激光激发下发出荧光，根据其本身标记的荧光和激发后发出的荧光综合分析进行检测。其在小样本、高通量、操作简便、快速准确、敏感度、特异度高等方面优于传统的分析方法，而且其所有反应均在液相中进行，保持天然构象，有利于探针和待测物充分反应，目前已广泛用于各类核酸及蛋白检测，如基因分型、抗原/抗体检测、感染性疾病诊断等，其中HPV检测及分型试剂盒、呼吸道病毒检测试剂盒、细胞因子检测试剂盒、肿瘤标志物检测试剂盒等已经在美国和中国经FDA及SFDA批准用于临床检测。

发明内容

本发明的目的主要是提供一种高特异度、灵敏度，且具有同时检测多个样本、多个指标能力的试剂盒。

本发明通过下述技术方案实现：

流式液相芯片急性高原病脯氨酰羟化酶基因rs480902位点检测试剂盒，该试剂盒包含特异性荧光微球交联探针微球杂交液、特异性PCR引物混合液、预混液、藻红蛋白荧光标记链霉亲和素（SA-PE）；

其中，特异性荧光微球交联探针及特异性PCR引物和探针序列如下：

E-F5-2：5'-CAAGTGATCTCCCAGTGACTCTT-3'

E-F6-2：5'-CAAGTGATCTCCCAGTGACTCTC-3'；

E-R3：5'-GCAAAGTCAGAAAGCGGTG-3'；

E-P0707：5'-GGACCTTAGACCAGCACTTCT-3'。

进一步地，所述预混液由4XBuffer、dNTPs、TaqPolymerase组成。

具体地，预混液的用量为：10μl，特异性PCR引物混合液的用量为：2μl。

另外，所述试剂盒还包含ddH₂O。具体地，ddH₂O的用量为：6μl。在进行检测时，待检DNA的用量为：2μl。

此外，所述特异性荧光微球交联探针微球杂交液是由探针E-P0707与22号荧光微球耦联、TE缓冲液及四甲基氯化氨杂交缓冲液制备。

上述试剂盒在实际使用过程中的PCR反应条件为：首先热启动95℃10min，然后进入35个循环；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min。

取PCR产物3μl与22μl微球杂交液混合，95℃变性5min，48℃杂交30min后，加入SA-PE75μl，48℃温育15min。使用Luminex200流式荧光分析仪检测杂交产物。

本发明具有以下优点及有益效果：