[发明专利]可避免假阴性的手足口病毒EV71恒温荧光检测引物组、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.用于检测手足口病毒EV71的恒温荧光检测引物组合物，其包含一组检测引物和一组内标引物，其中，所述检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

EVV-F3：5’-CCTGCGAGTGCTTATCAAT-3’；

EVV-B3：5’-TAGGTAGTTCTGGTTACGCA-3’；

EVV-FIP：5’-CTGAGAACGTGCCCATCATGTCCACATTCGGAGAACACAA-3’；

EVV-BIP：5’-GGACTGTGGGGACCTCCAACGTGCTTCATTCTCATGTAA-3’；

EVV-LF：5’-ATTAGGACATGCCCCGTATTC-3’；

EVV-LB：5’-GTCCAAGTACCCTTTAGTGGTT-3’；

所述内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

EVF-F3：5’-GCATTCCGCTCATTAGATGA-3’；

EVF-B3：5’-GAGGCTGATAACAAGGCTT-3’；

EVF-FIP：5’-TGGTTAAGCGCCTCAATACAGGCGCTCAGACAACTGATTGTA-3’；

EVF-BIP：5’-CGCTCAGTTGGCAACAAAGCATAAACTGTGTTATAGCGGAGG-3’；

EVF-LoopF：5’-CAGGTAGCGCCTCCATATC-3’；

EVF-LoopB：5’-CCAGATTTACCTGCTGGTATCA-3’。

2.一种手足口病毒EV71的恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒包括权利要求1所述的检测引物组和内标引物组。

3.根据权利要求2所述的手足口病毒EV71的恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，所述检测引物组及内标引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1-2：4-8：2-4。

4.根据权利要求2所述的手足口病毒EV71的恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：（1）DNA聚合酶；（2）反应液；（3）反转录酶；（4）内标靶标片段；（5）阳性对照和阴性对照。

5.根据权利要求4所述的手足口病毒EV71的恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，所述反转录酶为AMV反转录酶。

6.根据权利要求4所述的手足口病毒EV71的恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，所述恒温荧光反应液含有：6mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO₄水溶液、三者的体积比是8：4：3。

7.根据权利要求4所述的手足口病毒EV71的反转录恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，阳性对照为含有手足口病毒EV71EVV基因片段的T载体克隆，阴性对照为超纯水，内标靶标片段为含有手足口病毒EV71EVF基因片段的T载体克隆。

8.一种手足口病毒EV71的恒温荧光检测方法，包括如下步骤：

（1）待检样品RNA的提取：采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA；

（2）利用权利要求1的恒温荧光引物组合物对待检样品RNA进行反转录恒温扩增；

（3）结果判断：将反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据EVV基因检测结果和内标基因EVF检测结果进行判断：

EVV基因检测结果为阳性内标基因EVF检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；

EVV基因检测结果为阴性内标基因EVF检测结果全为阳性时，检测结果为阴性；

EVV基因检测结果为阳性内标基因EVF检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；

EVV基因检测结果为阴性内标基因EVF检测结果全为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取RNA进行检测。