[发明专利]一种FTH1基因可控表达的稳定细胞株的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及细胞株的构建。

背景技术

临床上，磁共振成像(MRI)广泛用于对疾病的诊断、分期、随访及预后判断；在分子影像学领域，MRI因为空间分辨率高，软组织对比度好以及无辐射损伤等优势具有较大应用潜力，尤其适用于对移植细胞示踪的研究。MRI主要通过磁标记成像和报告基因成像两种方式实现对移植细胞的示踪，前者采用MRI对比剂如金属螯合物或者超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)直接标记细胞。由于SPIO横向弛豫率高，目前在细胞示踪成像上应用广泛。但是，这种利用MRI对比剂直接标记细胞的方法，存在一个很大的缺陷，即对比剂会随着细胞的分裂增殖逐渐降解，因而无法对移植细胞进行长期示踪。磁共振报告基因成像借助报告基因在细胞内持续稳定表达，能够克服上述磁标记成像存在的缺陷，很大程度上可实现对移植细胞的长期活体示踪。

目前用于MR显像的报告基因有多种，如β-半乳糖苷酶、酪氨酸酶、转铁蛋白受体、MagA和铁蛋白基因等。在众多的MRI报告基因中，铁蛋白基因作为一种内源性报告基因近年来备受关注。铁蛋白为一种储铁蛋白，有重链和轻链两种亚基。其中，铁蛋白重链多肽1(FTH1)具有亚铁氧化酶的活性，可以促进铁的氧化和掺入，作为一种功能性磁共振报告基因已成为分子影像学研究的热点。

然而，FTH1作为MRI报告基因的安全性是值得考虑的。目前，对FTH1表达对细胞有无影响的研究结果不完全一致。一些研究证明FTH1是一种抗凋亡基因，它可以增加细胞或组织对抗氧化应激的能力。然而，也有报告指出，在某些特定的细胞如宫颈癌Hela细胞、鼻咽癌细胞中，FTH1的过表达会明显降低细胞的增殖活性。此外，以铁为成像介质的报告基因长期持续表达还会诱发铁代谢紊乱。虽然铁是新陈代谢中多种生物活性酶的重要辅助因子，然而，过多的铁会诱发大量活性氧自由基产生，从而导致细胞的损伤或凋亡。

发明内容

基于上述技术问题，为了尽量减少FTH1持续表达并聚铁带来的不利影响，本发明对FTH1的表达水平和表达时间进行了精确调控，使其在需要MR成像时表达，不需要MR成像时关闭。

本发明的目的通过以下措施实现的：

一种FTH1基因可控表达的稳定细胞株的构建方法，包括以下步骤：

(1)获取FTH1基因；

(2)将FTH1基因转入Tet-On载体获得重组质粒；

(3)将重组质粒构建为慢病毒载体；

(4)接种人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)，待细胞融合达40-50％，加入慢病毒液0.8μl/ml(滴度为1×10⁹TU/ml)和聚凝胺5μg/ml，聚乙二醇0.5-1μg/ml的完全培养基，放入培养箱中培养20-24h；

(5)细胞传代后，细胞融合50-60％，加入8μg/ml嘌呤霉素的培养基处理7d，再加入4μg/ml嘌呤霉素的培养基筛选3d，获得可诱导表达FTH1基因的稳定细胞株，命名为SK-N-SH/Tet-on/FTH1。

在利用MRI报告基因对移植细胞标记显像的示踪过程中，问题之一是如何让携带报告基因的慢病毒成功、高效地感染目的细胞。在构建稳定细胞株过程中，由于基因片段的插入、病毒液以及筛选抗生素对细胞的作用，均会对细胞产生毒副作用，而本发明有效降低了这些因素对细胞的不利影响。另一方面，本发明使FTH1基因、Tet-On控制系统在SK-N-SH细胞乃至动物体内有效的整合，协同作用，实现精确控制、可控表达，并能在有机体内长期、稳定的通过MRI检测示踪。

上述FTH1基因可控表达的稳定细胞株的构建方法，包括以下步骤：

◆目的基因FTH1的获取：设计引物，上下游引物分别带有AgeI和FcoRI酶切位点；

FTH1-F：5’-AACCGTCAGATCGCACCGGTGCCACCATGACGACCGCGTCCACCTC-3’

FTH1-R：5’-TCCTTGTAGTCCATGAATTCGCTTTCATTATCACTGTCTC-3’

PCR扩增，其条件是：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；30cycle；72℃，10min；4℃保存；

◆将FTH1基因片段转入Tet-on载体构建重组FTH1/Tet-on载体；将重组FTH1/Tet-on载体转入DH5α感受态细菌；培养重组细菌，进行质粒抽提，-20℃保存；

◆重组质粒转染