[发明专利]扬子鳄抗病毒潜力检测的Ⅰ类MHC基因的特异性引物及分型方法

说明书

技术领域

本发明公开多对用于扩增扬子鳄抗病毒潜力检测的Ⅰ类主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)基因序列的单位点特异性引物及分型方法。

背景技术

扬子鳄(Alligator sinensis，Fauvel)属于爬行纲，鳄目，鼍科，短吻鳄亚科，鼍属，是一种古老的动物，起源于二亿三千万年前的三叠纪，被称为爬行动物中的“活化石”，为我国特有珍稀濒危动物、国家一级重点保护动物(1972)，在《濒危动植物国际贸易公约》(CITES)中被列入附录Ⅰ，同时被世界自然保护联盟(IUCN)归为极度濒危物种，是现存鳄类中受到威胁最大、最为濒危的物种之一。目前野生扬子鳄的数量仅约100条。

约2.3亿年前，扬子鳄的祖先与地球曾经的霸主恐龙生活在同样的环境中。然而，强大的恐龙在6500万年前神秘消失，鳄鱼却奇迹般生存了下来，并繁衍至今。作为一种古老的爬行动物，扬子鳄无论是形态还是行为上都保留着爬行类祖先的许多特征，是古生物学、物种演化过程研究中不可或缺的一个物种。

主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)为存在于脊椎动物染色体特定区域的一组连锁基因群，在脊椎动物免疫系统中起到关键作用，其编码的免疫细胞表面受体种类丰富，是免疫系统中呈递抗原和调节机体免疫应答反应过程中的重要作用因子。根据所呈递抗原类型的不同，MHC可以分为两大类：Ⅰ类和Ⅱ类，其中Ⅰ类MHC基因所编码蛋白的抗原结合区主要识别并结合内源性抗原(如病毒)的多肽，将其呈递给CD8+T细胞，并启动后续的免疫反应。因此，Ⅰ类MHC的抗原结合区(外显子2和3)普遍具有高度多态性，Ⅰ类MHC抗原结合区多态性高的个体能够更好的抵抗病毒的入侵。通过评估种群中Ⅰ类MHC多态性，保护工作者在进行新建种群选择奠基者与野外放归选择适应性能力强的个体等工作时，可以根据多态性高低进行科学地选择，在圈养种群进行人工配对时，亦可以选择具有不同等位基因的个体配成一对从而提高子代的多态性，增强子代对病毒性疾病的抵抗力。

在已有的扬子鳄MHC文献中，均是利用通用引物进行MHC基因的位点交叉扩增，其结果只能用于简单的进化分析。本而发明涉及的多对Ⅰ类MHC引物均经过大量实验重复验证，不仅能在扬子鳄种群中顺利扩增，展现出稳定的单位点特异性扩增能力，还能通过后续的单链构象多态性(SSCP)对扬子鳄Ⅰ类MHC基因进行基因分型，有效帮助我们评估种群中个体Ⅰ类MHC多态性，给扬子鳄保护工作带来了极大的便利。

发明内容

本发明目的是提供多对用于扩增扬子鳄抗病毒潜力检测的Ⅰ类MHC基因序列的引物及其分型方法。

一套用于扩增扬子鳄Ⅰ类MHC基因的单位点特异性引物，其引物具体序列为

引物对一：上游引物I1327E2F：GTGGGTAAGCGGCCCTCTGC(如SEQ ID NO:1所示)；

下游引物I1327E2R：CTGCCCTCCCTGCCCCCCCCG(如SEQ ID NO:2所示)；

引物对二：上游引物I1327E3F：AGGGGCCTGGATCTGTGTTTG(如SEQ ID NO:3所示)；

下游引物I1327E3R：CCTGGTTAGTGCTGCCGTTA(如SEQ ID NO:4所示)；

引物对三：上游引物I20E2F：GCCCGCTAGTGCTGACCATC(如SEQ ID NO:5所示)；

下游引物I20E2R：CCTGCTCACACCTGCCTGCTA(如SEQ ID NO:6所示)；

引物对四：上游引物I20E3F：TCAGCCTGGAAGCCCTCAA(如SEQ ID NO:7所示)；

下游引物I20E3R：GGCGGGAATTGCCTGGGT(如SEQ ID NO:8所示)；

本发明还公开了一种扬子鳄抗病毒潜力检测的Ⅰ类MHC基因的分型方法，即采用上述各对引物，用10μLPCR体系在特定扩增条件下进行目标片段扩增，然后将扩增产物分别利用SSCP进行基因分型。

所述的10μLPCR体系为：扬子鳄血液DNA 0.8μL，上下游引物各0.2μL，超纯水4.4μL，2×UltraTaq Master Mix 4.4μL。