[发明专利]促进畜禽生长的GM-CSF基因与SS基因共表达DNA疫苗pIRES-GM-CSF/2SS的方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物医药生物工程领域，尤其是一种促进畜禽生长的粒细胞-集落刺激因子GM-CSF基因与生长抑素SS基因共表达DNA疫苗pIRES-GM-CSF/2SS的方法。

背景技术

对于肉用的动物来说，生长速度、产肉率、饲料利用率等是衡量肉用动物的主要指标，可以从营养方面调控，也可以从生长发育方面调控。

动物的生长轴是由动物体内下丘脑-垂体-靶器官及其相关的激素和受体所组成的具有自动调节的神经内分泌系统。下丘脑释放生长激素释放因子(Growthhormone-releasingfactor，GRF）、生长抑素(Somatostatin，SS)等相关的激素，但是最重要的是GRF和生长激素(Growthhormone，GH)。其中GRF是促进垂体释放生长激素，进而促进动物的生长。而SS则是抑制垂体释放GH，也就是说其具有抑制动物生长的作用。接着GH又可以直接作用于靶器官，或者通过肝脏分泌的胰岛素样生长因子(Insulin-likegrowthfactors，IGFs)再作用于靶器官，这就是动物生长轴的机理。动物的生长受到很多激素的调节，但是最重要的是GRF和SS，含有SS的生长抑素基因疫苗表达产生的抗体中和内源性SS，间接使GRF激素的分泌含量增加，从而促进畜禽的生长；粒细胞-集落刺激因子（GM-CSF）是一种具有多项潜能的造血生长因子，在细胞因子网络中占有重要地位，具有免疫增强作用，能增强生长抑素DNA疫苗的免疫效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进畜禽生长的GM-CSF基因与SS基因共表达DNA疫苗pIRES-GM-CSF/2SS的方法，该基因疫苗一次注射，能同时表达出SS和GM-CSF两个完全独立的蛋白，从而减少了工作量及对免疫动物的应激影响，能保持独立的免疫原性，增强了免疫效果。

本发明的目的是这样实现的：

一种促进畜禽生长的GM-CSF基因与SS基因共表达DNA疫苗pIRES-GM-CSF/2SS的方法，特征是：具体步骤如下：

A、将pIRES（共表达质粒载体）质粒用NheI和EcoRI进行双酶切，以pVGS/2ss-asd质粒为模板，PCR获取猪GM-CSF基因，胶回收GM-CSF基因与T载体进行连接反应，构建阳性重组质粒pIRES-GM-CSF；

B、以pVGS/2ss-asd质粒为模板，用NheI和HindⅢ进行双酶切，PCR获取猪SS基因，用NotI和SalI进行双酶切与T载体进行连接反应，构建T2SS质粒；

C、采用NotI和SalI内切酶分别酶切pIRES-GM-CSF质粒和T2SS质粒，将纯化、回收的pIRES-GM-CSF大片段和2SS片段进行连接反应，构建真核表达质粒pIRES-GM-CSF/2SS，得到DNA疫苗pIRES-GM-CSF/2SS（GM-CSF基因与SS基因共表达DNA疫苗）。

pIRES-GM-CSF/2SS疫苗是在真核表达载体pIRES的MCSA和MCSB两个多克隆位点分别插入GM-CSF和SS基因，在真核动物中可同时独立表达出完全独立的GM-CSF和SS蛋白，可用来促进畜禽生长。

pIRES-GM-CSF/2SS疫苗采用一次注射，它能同时表达出SS和GM-CSF两个完全独立的蛋白，从而减少了工作量及对免疫动物的应激影响，能保持独立的免疫原性，增强了免疫效果。

附图说明

图1为本发明的pIRES-GM-CSF/2SS质粒的构建图。

具体实施方式

下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。

一种促进畜禽生长的GM-CSF基因与SS基因共表达DNA疫苗pIRES-GM-CSF/2SS的方法，具体步骤如下：

1共表达基因疫苗pIRES-GM-CSF/2SS的构建及鉴定方法（技术路线见图1）

1.1引物的设计与合成

采用Primer5.0软件设计引物，分别根据猪的GM-CSF序列和2SS片段（含有乙肝表面抗原S基因）序列设计扩增GM-CSF和2SS片段的引物（见表1），设计引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2　pIRES质粒的提取与酶切