[发明专利]Wasabi蛋白纳米抗体及其编码序列与应用

说明书

本发明公开了一种Wasabi蛋白纳米抗体在检测Wasabi蛋白中的应用，双抗体夹心酶联免疫吸附试验的方法，从而来定量检测含Wasabi蛋白标签的融合蛋白。首先从骆驼中筛选得到Wasabi蛋白特异性单克隆抗体，将该抗体在大肠杆菌中表达，然后包被Wasabi蛋白纳米抗体，利用酶联免疫吸附的方法检测。同时本发明也公开了一种Wasabi蛋白纳米抗体的核苷酸序列以及氨基酸序列。这一种Wasabi蛋白纳米抗体均可以在大肠杆菌内进行高可溶性表达。本发明用来进行Wasabi蛋白标签融合蛋白的定量检测具有：操作简便、高特异性、高灵敏度等优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及Wasabi蛋白纳米抗体及其在检测Wasabi蛋白中的应用。

背景技术

Wasabi蛋白是一种近年来发现的变体绿色荧光蛋白，它的荧光大约是EGFP的2倍，因为其优异的特性，在未来会替代现在使用较多的EGFP和GFP等绿色荧光蛋白。Wasabi蛋白以其本身所具有的荧光特性而成为用途非常广泛的蛋白标签，为检测或纯化目的蛋白提供了便利。含Wasabi蛋白标签的融合蛋白表达后，可以通过荧光显微镜对其进行定性检测，但是在很多情况下仍然需要对其进行定量检测。如今对含有Wasabi蛋白标签的重组蛋白的定量检测方法主要是针对重组蛋白的免疫印迹，但是免疫印迹属于半定量，并且实验所需时间较长，步骤繁琐。

1993年比利时的Hamers Casterman报道了在骆驼血清中不仅存在由2条H链和2条L链构成的IgG1型常规抗体，还存在缺失轻链的IgG2和IgG3亚型的重链抗体(heavy-chainantibody，hcAb)这类抗体的抗原结合位点仅由重链的可变区VHH(variable domain ofthe heavy chain of HCAbs,VHH)单结构域形成，尽管天然缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力。由于其在可变区，框架FR2区存在一些不同于常规抗体的亲水性氨基酸，使得VHH抗体在水溶液中具有良好的稳定性。VHH抗体是目前所发现的具有完整功能的最小分子抗体片段，其分子高度4.8nm，直径2.2nm，故被称为单域抗体或纳米抗体(nanobody)。纳米抗体重要的特征之一是其具有更为伸展的抗原互补决定区(CDR)，可结合一些常规抗体无法接近的抗原表位。如位于酶蛋白裂隙中的活性中心结构。纳米抗体，它还具有易表达，水溶性好，稳定性强，免疫原性弱，组织穿透性好等优点，使得该抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、药物开发等领域有广阔的应用前景。

获得纳米抗体的编码序列以及氨基酸序列是通过噬菌体展示技术，对构建的纳米抗体文库进行高效率的筛选，从而使特异结合的克隆得到高度富集。噬菌体展示技术是一种噬菌体表面表达筛选技术，其原理是以噬菌体为载体，将外源核酸片段克隆至噬菌体外壳蛋白基因中，并以外壳蛋白融合蛋白的形式表达于噬菌体表面，组成了噬菌体展示库。然后用固定化的靶分子去筛选与之亲和的噬菌体，不能结合的噬菌体被洗脱掉，而能结合的噬菌体被保留下来并通过感染大肠杆菌得以扩增和富集，实现高通量筛选。特异性噬菌体得到富集后，对其进行基因测序得到编码序列，进而进行原核表达得到具有活性的纳米抗体。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种针对Wasabi表位的纳米抗体。同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种Wasabi蛋白纳米抗体，所述的Wasabi纳米抗体的VHH链包括框架区和互补决定区，

其中，

所述的框架区包括以下4段氨基酸序列：如SEQ ID NO：1所示的FR1，如SEQ ID NO：2所示的FR2，如SEQ ID NO：3所示的FR3，如SEQ ID NO：4所示的FR4；所述的互补决定区包括以下3段氨基酸序列：如SEQ ID NO：5所示的CDR1，如SEQ ID NO：6所示的CDR2，如SEQ IDNO：7所示的CDR3；

或者，