[发明专利]一株产β-葡萄糖苷酶根霉及其发酵产酶方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种匍枝根霉及其筛选方法、匍枝根霉作为生产β-葡萄糖苷酶的应用、β-葡萄糖苷酶的生产方法。

背景技术

纤维素酶是由三种不同的酶组成的多酶复合物：外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶(BGL)，三种酶协同作用完成对纤维素的水解。目前使用的纤维素酶生产菌株由于β-葡萄糖苷酶活力相对较低，大幅度限制了纤维素酶对纤维质的总体水解速率，使得β-葡萄糖苷酶作为纤维素酶水解纤维素过程的限速酶而成为酶解木质纤维素生产燃料乙醇的技术瓶颈。

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21，BGL)，又称β-D-1，4-葡萄糖苷水解酶，常与内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4,EG)和纤维二糖水解酶(EC3.2.191，CBHs)共同构成一组可对纤维素进行高效协同作用的纤维素酶系。β-葡萄糖苷酶可将纤维二糖彻底水解并释放葡萄糖，同时该酶常因微生物自然分泌量的不足而成为整个纤维素酶系水解过程中的主要限速酶。β-葡萄糖苷酶对纤维二糖的水解活性最强，但由于β-葡萄糖苷酶对底物(糖基)部分结构的专一性较差，使得β-葡萄糖苷酶不仅能够使C-O、C-S、C-N和C-F等键断裂，还可以水解β-半乳糖苷键，甚至由于对糖分子结构中C₆位的专一性不高而能够水解木糖，这使得β-葡萄糖苷酶除了可以与其它纤维素酶组分协同水解纤维素外，还可以单独在糖苷转移或水解、制茶以及食品增香等多个领域使用。

β-葡萄糖苷酶广泛分布于细菌、霉菌、酵母、植物和动物等物种中，其中小型丝状真菌由于产量高、酶系丰富、易于廉价培养和发酵控制等特点，被认为是β-葡萄糖苷酶良好的生产菌株。目前关于β-葡萄糖苷酶生产和研究的丝状真菌主要有木霉属、曲霉属和青霉属微生物，但是它们的发酵周期一般在6d以上，具有耗时长、效率低等特点。

发明内容

针对以上不足，本发明提供了一种匍枝根霉及其筛选方法、匍枝根霉作为生产β-葡萄糖苷酶的应用、β-葡萄糖苷酶的生产方法，该匍枝根霉菌株可以豆粕、硫酸铵、尿素、氯化铵为氮源，以麸皮汁、乳糖、淀粉糖、稻草秸秆、玉米秸秆等为碳源经液态发酵生产β-葡萄糖苷酶，所生产的β-葡萄糖苷酶可以被应用于生物质能源、纺织和食品等方面。

匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)TP-02，保藏编号为：CGMCCNo.11119。保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年7月16日，保藏地址为：中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)TP-02是从黄山腐木中筛选得到的。该菌株在土豆培养基平板上生长速度快，生长初期菌丝为白色，培养后期产生大量黑褐色分生孢子。

本发明还提供了匍枝根霉的菌种筛选方法，包括以下步骤：培养基平板初筛、摇瓶复筛、发酵培养、菌种鉴定。

所述培养基平板初筛所用培养基平板的配方为：每L培养基含有：土豆浸出汁20g，葡萄糖20g，卡那霉素100mg，琼脂粉20g；

所述摇瓶复筛所用种子培养基的配方为：每L培养基含有：土豆浸出汁200g，乳糖10g；

所述发酵培养所用发酵培养基的配方为：每L培养基含有：稻草秸秆10g，5％麸皮浸出汁100g，(NH₄)₂SO₄3g，KH₂PO₄1g，MgSO₄·7H₂O1g，CaCl₂2g，失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚0.025g。

本发明还提供了匍枝根霉作为生产β-葡萄糖苷酶的应用。

本发明还提供了一种β-葡萄糖苷酶的生产方法。该方法具有发酵周期短、耗时短、效率高的特点。

其技术方案为：一种β-葡萄糖苷酶的生产方法，包括以下步骤：

(a)制备种子培养液，将权利要求1所述的匍枝根霉在种子培养基中培养后进行接种；

(b)使用产β-葡萄糖苷酶培养基液态发酵β-葡萄糖苷酶。

(c)使用primeplus纯化系统对β-葡萄糖苷酶进行纯化

所述步骤(a)具体包括：菌种在斜面培养基中培养3d后用无菌水洗下孢子，使用血球计数板计算孢子数并稀释至1×10⁵个/mL。按1％体积接种量接入种子培养基中，于30℃、200rpm条件下培养24h后作为种子液备用，使用-80℃超低温甘油冻结管保藏法保藏种子液。