[发明专利]人骨形成蛋白2成熟肽及其表达

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质或多肽技术领域，具体而言，本发明涉及人骨形成蛋白2(尤其是重组产生的，简称为rhBMP2)及其药物和促骨分化钙化应用等。

背景技术

骨形成蛋白(BMP)，又称人骨形态发生蛋白，除人骨形成蛋白1(BMP1)之外，其余均属于转化生长因子-β超家族，其中研究得较多的是人骨形成蛋白2(BMP2)，例如，中国专利申请第98113048号公开了用于治疗造血功能障碍和损伤的可溶性重组人骨形成蛋白2，其中的BMP2是野生型蛋白；中国专利申请第200610032800号公开了一种重组人骨形成蛋白-2的表达方法，其中的BMP2也是野生型蛋白；中国专利申请第201410310953号公开了一种重组人骨形态发生蛋白-2截短体及其优化表达方法，其中获得的蛋白共有115个氨基酸残基；中国专利申请第200910045832号也公开了一种重组人骨形成蛋白-2截短体及其优化表达方法，其中获得的蛋白共有114个氨基酸残基，其产量最高在10mg/L左右。

然而，除了本发明人之外，再也没有人继续研究更为截短的BMP2了。本发明人没有受现有技术趋势的影响，数十年致力于BMP2(尤其是rhBMP2)的开发研究，在截短的极限下，又十分令人意外地研发出一种新的人骨形成蛋白2，其促骨分化钙化的能力提高，从而具有更好的骨形成活性/疗效，更具有实际药用推广前景。另外，本发明人还研发了一种新的人骨形成蛋白2的编码基因，其跳出了现有的密码子优化的框架，获得了全新的编码基因，能够在大肠杆菌中大幅提高表达量，非常适合基因工程的产业化生产。

发明内容

本发明的要解决的技术问题在于提供新的人骨形成蛋白2及其药物和促骨分化钙化应用等。另外，本发明还提供了人骨形成蛋白2的基因工程制备方法及其多核苷酸等。

具体而言，在第一个方面，本发明提供了人骨形成蛋白2，其氨基酸序列

(1)如SEQIDNO：2所示；或

(2)是在SEQIDNO：2所示序列上添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的，而且其促骨细胞分化钙化的能力提高。

本发明的第一个方面的人骨形成蛋白2的氨基酸序列可以是在SEQIDNO：2所示序列上添加、缺失和/或取代一个或几个(优选一个至五个，更优选一个至三个)氨基酸残基而得的氨基酸序列。本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。在取代的氨基酸残基中，优选取代为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸，从而更得以保持原有功能活性。侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。在本发明的具体实施方式中，人骨形成蛋白2的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示或者在其N端增加一个甲硫氨酸(M)残基，其经国家权威部门鉴定，符合规定。

优选本发明的第一个方面的人骨形成蛋白2相对于其他的截短的BMP2的促骨分化钙化提高。其中，其他的截短的BMP2包括中国专利申请第201410310953号和中国专利申请第200910045832号的BMP2。优选本发明的第一个方面的人骨形成蛋白2的促骨分化钙化效果较中国专利申请第201410310953号和中国专利申请第200910045832号的BMP2有提升。

在第二个方面，本发明提供了多核苷酸，其编码本发明的第一个方面的人骨形成蛋白2。本发明的多核苷酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是编码链或模板链。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以获得编码本发明的第一个方面的多肽的核酸分子或其片段。这些序列一旦获得，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过培养宿主细胞进行增殖。优选本发明的多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。该优选序列没有受常规表达优化密码子的限制，优化了在大肠杆菌中的表达，表达效果有更大幅提升。