[发明专利]一种体外诱导BM-MSCs转分化为汗腺细胞的microRNA诱导方法

说明书

本发明涉及人汗腺再生研究领域。具体说来，本发明涉及一种在体外培养条件下，通过小分子干预技术，利用microRNAs诱导成体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM‑MSCs)转分化为汗腺细胞的方法。

技术领域

本发明涉及人汗腺再生研究领域。具体说来，本发明涉及一种体外诱导骨髓间充质干细胞转分化获得汗腺细胞的microRNA诱导方法。

背景技术

汗腺再生一直是创烧伤领域的热门课题，其意义在于通过在深度烧伤创面建立汗腺组织，解决烧伤患者不能分泌汗液的问题，以提高患者的生活质量。

研究表明，BM-MSCs可直接参与了皮肤损伤修复与再生的全过程，其中包括：皮肤组织损伤后，造血干细胞和间充质干细胞从骨髓动员到循环细胞池，并迁移到损伤部位。从2003年起，我们又开始了体外诱导MSCs向汗腺细胞分化的实验研究。利用BM-MSCs来再生汗腺的主要优点包括：一是BM-MSCs本身具有低免疫源性和多向分化潜能；二是BM-MSCs存在于骨髓基质，在大面积创伤、烧伤时受到外界的直接破坏作用比较小；三是储存量比较大，在严重创伤和烧伤条件下能够发生动员，容易获取。基于以上原因，深入开展BM-MSCs的分化调控研究对皮肤汗腺再生策略具有重要的理论意义和应用价值。

我们发现，MSCs经过在体外与汗腺细胞共培养后，可以转分化为汗腺细胞。在此基础上，我们又获得了以下几方面的突破：1)通过共培养技术，可以将人MSCs成功诱导为汗腺细胞，并可在体外大量扩增，为成体干细胞跨胚层转分化的研究提供了可靠数据；2)免疫组织化学和流式细胞术等方法证实这些来源于MSCs的汗腺细胞，可以表达汗腺细胞的重要标志癌胚抗原(CEA)、CK8、CK18和CK19等；3)初步阐明在MSCs转分化为汗腺细胞的过程中涉及的信号通路主要有EDA-A1/EDAR/NF-кB和ERK的激活；4)在此基础上，将上述通过细胞共培养技术获得的汗腺细胞局部移植于裸鼠烫伤脚掌，观察到有汗腺组织再生，并且碘-淀粉发汗试验检测为阳性；5)进一步进行的2例人体移植实验，证明了这种从MSCs诱导产生的汗腺细胞可以在人体切除瘢痕的创面长出汗腺样结构，并且具有发汗的功能；6)移植术后3个月和1年的随访表明，移植了从MSCs诱导产生的汗腺细胞的创面，汗液成分分析以及组织学检查均证明这些再生的汗腺不仅具有类似正常汗腺的结构，而且具有持续分泌正常汗液的功能。

但上述以共培养为基础的诱导体系还需要进一步改进和完善。一方面共培养体系需要原代分离大量的汗腺细胞，但原代汗腺细胞难分离，而且不能传代，不能计数，因此提供的诱导微环境体系不稳定。另外，还存在细胞融合和细胞容易混杂等缺点。而本技术发明了一种骨髓间充质干细胞转分化为汗腺样细胞的microRNA诱导方法。我们选择靶向性调控NF-кB的microRNA即has-miR-138-5p inhibitor，转染BM-MSCs后，流式分选阳性细胞，并继续培养分选后的BM-MSCs 7-9天获得汗腺或汗腺样细胞。

发明内容

因此，本发明提供了一种骨髓间充质干细胞转分化为汗腺样细胞的microRNA诱导方法，包括以下步骤：

a)分离并培养BM-MSCs，用免疫细胞化学法鉴定其表面标志性蛋白CD44。

b)利用Lipo2000将has-miR-138-5p inhibitor转染到第三代BM-MSCs。has-miR-138-5p inhibitor的转染浓度为600pmol，转染时BM-MSCs的密度为3×10⁵/ml。

c)流式分选转染阳性的BM-MSCs细胞。

d)继续培养分选后的BM-MSCs 7-9天并获得汗腺或汗腺样细胞。

附图说明