[发明专利]一种N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶试剂及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶检测技术领域，特别涉及一种N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶检测试剂，还涉及使用此检测试剂的检测方法。

背景技术

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）是存在于细胞溶酶体内的一种水解酶，广泛分布于人体各组织中，但在前列腺和肾脏近端肾小管中含量最高。NAG分子量约为130-140KD，在正常情况下，血清中NAG不能通过肾小球从尿中排泄。尿中NAG主要来自肾近曲小管上皮细胞，但健康人尿中含量甚微。尿NAG活性水平的增高，是早期肾损伤和糖尿病微血管病变的敏感指标。NAG活性可用于肾小管间质性肾炎、尿路感染、糖尿病肾病综合症、高血压肾病、肾移植后的排异反应和肾病综合症的早期诊断。上述疾病时NAG活性的升高均早于其他相应指标，有利于疾病的早期发现和及时治疗。NAG活性还可用于重金属等肾毒性物质环境污染的人群筛查、职业病调查等。

目前，NAG的应用广泛的检测方法有PNP-NAG法、CNP-NAG法，MPT-NAG法等方法。PNP-NAG法是以P-硝基苯酚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(PNP-NAG)做为底物，在NAG作用下，生成N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰氨基葡萄糖在N-乙酰氨基葡萄糖氧化酶(NAGOD)的作用下生成H2O2。H2O2在过氧化物酶(POD)的作用下与高灵敏的发色剂双〔3-双(4-氯酚)甲基-4-二甲氨苯基〕胺(BCMA)反应，生成绿色色素。通过测定此色素可求得NAG的活力。此底物价廉，容易获得，但是必须设定样本空白，而且操作时间较长，不适合大批量自动化分析。CNP-NAG法是以2-氯-4-硝基苯乙酰氨基葡萄糖苷为底物，经NAG酶解后的产物不需碱化可直接呈色，，无需设样品空白，可实现大批量自动化操作，但底物较难溶，测定时需严格控制缓冲液pH值，底物溶液以新鲜配制为宜，操作繁琐。MPT-NAG是的测定原理是NAG催化6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG）水解，生成产物6-甲基-2巯基吡啶（MPT），MPT在340nm处有强烈吸收能力，通过测定340nm处每分钟的吸光度增加速度计算NAG的活力。

在此基础上，本发明使用了新型的VRA-NAG[（4-（3-甲基-苯乙烯）-绕丹宁-3-乙酸氨基-N-乙酰氨基-beta-D-葡萄糖苷]物，它是一种新的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的衍生物，它与其他的底物相比具有水溶性好，稳定性强的优点。此外，采用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系，并添加多种表面活性剂起助溶作用，稳定剂起稳定作用，是一种更加稳定，抗干扰能力更强的NAG试剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测尿液中NAG的试剂及使用该试剂检测NAG含量的方法。该试剂盒采用VRA-NAG作为新型底物，可以更加有效的检测NAG含量，具有稳定性好，抗干扰能力强的特点。

基本原理

底物VRA-NAG在样品中的NAG的催化下，水解释放出有色化合物集团VRA，它在505nm波长处有吸收峰，检测505波长处吸光度的增加值就可以计算出NAG活性。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种NAG检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：

1)试剂R1的组分为：

缓冲液...............................................................100mmol/L

VRA-NAG.........................................................3mmol/L

BSA....................................................................1g/L

乙二醇................................................................1ml/L

TritonX-100.........................................................1ml/L

抗坏血酸氧化酶..................................................1ml/L

防腐剂..................................................................2mmol/L