[发明专利]PQQ-sGDH突变体、聚核苷酸及葡萄糖检测装置

说明书

本发明提供一种可溶性吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶(PQQ‑sGDH)突变体，其氨基酸位置对应于醋酸钙不动杆菌的野生型PQQ‑sGDH序列SEQ ID NO 1，所述PQQ‑sGDH突变体携带的突变包括以下一组突变中的一种：A194F、基于A194F的组合突变、基于Q192A的组合突变或基于Q192S的组合突变。这些PQQ‑sGDH突变体具有良好的葡萄糖底物特异性，对麦芽糖等糖的交叉反应性显著下降，特别适合用于检测血液等样品中的葡萄糖。

技术领域

本发明涉及可溶性吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶(PQQ-sGDH)突变体，具体而言就是以醋酸钙不动杆菌野生型PQQ-sGDH编码基因或其编码蛋白同源性在90％以上的DNA作为模板，利用PCR扩增进行定点突变，获得一系列具有良好的葡萄糖底物特异性和/或热稳定性且对麦芽糖的交叉反应性显著降低的PQQ-sGDH突变体。同时还提供编码所述PQQ-sGDH突变体的聚核苷酸、包含所述聚核苷酸的表达载体、包含所述表达载体的转化细胞以及利用所述PQQ-sGDH突变体检测样品中葡萄的方法、试剂和装置。

背景技术

血糖浓度是糖尿病的一个非常重要的标志物。血糖浓度的测定在糖尿病的临床诊断和管理中极为重要。血糖的检测通常涉及酶催化下的葡萄糖氧化。根据酶的类型不同，可分为葡萄糖氧化酶(GOD)和葡萄糖脱氢酶(GDH)。在利用试纸条和血糖仪检测血糖时，GOD虽然具有较高的特异性，也不受到葡萄糖之外的糖类物质的干扰，但是极易受到血液中氧气的干扰而导致测定结果不准确。而GDH则不受到血液中氧气的干扰，因而得到广泛应用。

对GDH而言，根据其辅酶的不同，它大致可分为吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶(PQQ-GDH)，黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(NAD-GDH)。作为GDH中的一种，PQQ-GDH使用吡咯喹啉醌(PQQ)作为辅酶。

PQQ-GDH的EC编号早前为EC 1.1.99.17，后被更改为EC 1.1.5.2。目前科学家们已在细菌中发现两类PQQ-GDH(EC 1.1.5.2)：第一种为膜结合的PQQ-GDH(PQQ-mGDH)；第二种是可溶性的PQQ-GDH(PQQ-sGDH)。这两种PQQ-GDH的生化性质差异较大。PQQ-sGDH只在不动杆菌属细菌的周质空间(periplasmic space)中发现，如醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoacelicus)和鲍曼氏不动杆菌(A.baumannii)，以下以醋酸钙不动杆菌为例进行说明。

醋酸钙不动杆菌同时含有上述两种不同的PQQ-GDH，其中，PQQ-mGDH只在细菌细胞内是有活性的，而PQQ-sGDH只在细菌细胞外表现出活性。此外，它们的序列并不存在显著的同源性。PQQ-sGDH是由两个相同的亚基组成的，每个亚基含有3个钙离子，每个亚基的分子量为50kD，每个亚基的N端是一个由24个氨基酸残基组成的信号肽，在分泌到周质空间中后被切除。PQQ-sGDH可以催化多种单糖和二糖氧化成相应的酮，酮再进一步水解成醛糖酸，并且，该酶可以将氧化反应时产生的电子提供给吩嗪硫酸甲酯(PMS)、2,6-二氯靛酚(DCIP)、沃斯特蓝(Wurster’s blue)以及短链泛醌分子如泛醌Q1和泛醌Q2以及某些人工电子受体，如N-甲基二甲基苯基吡唑酮硫酸甲酯(N-methylphenazonium methyl sulfate)，以及导电聚合物等。相比于PQQ-mGDH，PQQ-sGDH具有良好的水溶性和较广的电子受体特异性，因此，它非常适合用于试纸条或血糖仪的葡萄糖测定之中。

然而，醋酸钙不动杆菌的野生型PQQ-sGDH也有自身的缺陷，即底物特异性较差：不仅能与葡萄糖发生氧化反应，而且也能氧化麦芽糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、木糖和核糖等单糖和二糖分子发生氧化反应。这种反应性可能会使得一些糖尿病患者在测定自身血糖水平时获得错误的测量值。特别是当糖尿病患者静脉注射含麦芽糖或半乳糖或木糖制剂或者进行基于艾考糊精(icodextrin)的腹腔透析时，利用以PQQ-sGDH作为氧化酶的血糖仪测定的血糖值会错误性地升高，如果这些病人根据错误的血糖值接收治疗，可能会造成异常的低血糖症、昏迷，甚至死亡。