[发明专利]一种针对特定大小RNA片段的高通量测序文库构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及高通量测序文库构建技术领域，具体地说，涉及一种特定大小RNA片段的高通量测序文库构建方法。

背景技术

RNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链核糖核酸，其主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息传递过程中的桥梁。利用高通量测序技术对生物样本中的RNA进行测序，能够全面、快速的获得样本的在特定状态下的转录信息。

目前，RNA测序技术主要集中在真核生物的mRNA测序、小RNA分子测序等，现有的商业化试剂盒，如NEBRNA文库构建试剂盒、IlluminaRNA文库构建试剂盒等方法仅适用于真核生物，且这些文库构建方法均只能选择具有特定结构的RNA分子，如poly(A)，对于其大小无法进行选择。因此，需要对现有的文库构建方法进行改进，以实现依赖于特定大小RNA片段的高通量测序文库构建，如原核小RNA。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对特定大小RNA片段的高通量测序文库构建方法，以实现对原核小RNA等并无特殊结构的特定大小的RNA分子进行高通量测序。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种针对特定大小RNA片段的高通量测序文库构建方法，该方法包括以下步骤：

(1)去除总RNA中的DNA；

(2)去除总RNA中的rRNA序列；

(3)使用聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶筛选目的大小的RNA；

(4)在目的大小的RNA的3’端连接3’接头；以RNA为模板，加入与3’接头反向互补的逆转录引物进行退火，使3’接头与逆转录引物结合；

(5)在RNA的5’端连接5’接头；以RNA为模板，进行逆转录；

(6)使用P5引物与Index引物进行PCR反应，获得测序文库。

本发明方法的步骤(1)中，使用DNaseI在37℃下孵育，以消化DNA，实现RNA样本中DNA的去除。

本发明方法的步骤(2)中，使用与rRNA序列相匹配的探针与rRNA结合，以实现rRNA的去除，具体包括以下步骤：(1)可吸附探针磁珠的制备，使磁珠吸附探针的性能激活；(2)探针与rRNA的结合，通过在70℃下，RNA的二级结构会打开，当温度降低到25℃时，探针与rRNA根据碱基互补配对原则退火结合到一起；(3)将可吸附探针的磁珠与退火产物混合在一起，磁珠在吸附探针时，会将与探针结合在一起的rRNA一同吸附，在磁力架上实现rRNA的去除。

在步骤(1)的DNaseI处理后，需要进行酶失活与纯化操作，本发明将酶失活纯化与步骤(2)结合到一起，在70℃孵育时同时实现了酶失活与RNA二级结构的打开，降低了RNA在高温下降解的可能性。

本发明方法的步骤(2)中的rRNA包括5S、5.8S、16S、18S、23S、26S、28S、线粒体、叶绿体rRNA。

本发明方法的步骤(3)中，使用高浓度(15％-20％)的聚丙烯酰氨凝胶来实现高分辨率的RNA分子的分离，通过加入已知片段大小的RNA标记，实现对样本RNA大小的度量。

在步骤(3)-步骤(5)中，连接作用仅发生在单链RNA分子之间，单链与双链或双链之间无法连接，以实现在3’端与5’端连接不同的接头，从而最终实现测序的链特异性。3’接头可以为任何接头，如NEB的3’接头，步骤(4)的逆转录引物与3’接头是反向互补，步骤(5)的5’接头可以为任何接头，如NEB的5’接头。仅有两端均接上接头的片段在PCR时会放大。

步骤(6)所述的P5引物与3’接头反向互补，Index引物与5’接头反向互补，Index引物的3’端与5’接头是反向互补的，其5’端为测序P7端，在两者中间有5-8个标识碱基。在步骤(6)中，通过在PCR引物上额外的加入5-8个标识碱基，使不同样本在测序时能够区分开来。

本发明提供了上述高通量测序文库构建方法在特定大小RNA片段的高通量测序中的应用。