[发明专利]兔出血症病毒双抗夹心ELISA检测试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明属于动物病毒性疾病的检测和诊断试剂研究领域，具体涉及兔出血症病毒抗原的双抗夹心ELISA检测试剂盒及使用该试剂盒的检测方法。

背景技术

兔出血症(RHD)俗称“兔瘟”，又称“兔出血性肺炎”、“兔病毒性败血症”，是由兔血症病毒(RHDV)引起的一种急性、烈性、高度接触性和致死性传染病。本病潜伏期短、发病迅速、死亡率高，对易感兔的致死率打动90％以上，病死率高达100％。RHDV属于杯状病毒科，兔病毒属，该病毒科还包括水疱疹病毒属，札幌病毒属和诺瓦克病毒属，目前为止发现的RHDV毒株均为同一血清型，且与其他三个属均无交叉反应。该基因组为单股正链RNA分子，是兔群疾病中一种重要病原。目前认为该病只感染兔且可感染各种品种的兔，但对不同年龄的兔感染差异很大，一般来说生长期和成年兔极易感染，90日龄以下的幼兔感染率很低。

兔病毒性出血症发病时，病兔会出现体温升高、食欲不振等症状，临死前抽搐、尖叫、鼻孔出血，死后尸体呈角弓反张。病毒主要侵袭兔肝脏、脾脏和肺，病死兔解剖可发现肝脏出血坏死，脾脏肿大，肺部和气管水肿出血等明显病变。由RHDV致病机理研究可知，病毒进入机体后，感染血管组织内单核细胞并诱发其凋亡，导致血管内凝血，进而形成纤维性栓塞，使体内实质性脏器出血，缺氧，最终坏死，最后，感染兔会因为体内各种脏器功能性衰竭而死亡。

该病于1984年首先在我国江苏爆发，但经过调查发现，在1984年前的澳大利亚健康兔血清中就能检测到RHDV的抗体，说明在该病被发现之前澳大利亚就存在非致病的兔出血症病毒。该病流行三十年间，以蔓延至我国大部分地区，另外在美洲、欧洲和东南亚等世界范围内均有流行，已有四十多个国家出现了该病的报道，由于RHD传播迅速，毒力强，一旦发病，往往造成兔群全覆灭，给养兔业造成了巨大的经济损失。

目前该病的血清学诊断方法为传统的人“O”型红细胞的血凝抑制试验。但由于感染兔组织和血液中含毒量低，常常不足以产生血凝现象，检测率低，经检索，“在先申请201410267882.8公开了一种兔病毒性出血症病毒RT-LAMP检测方法，但是该方法敏感性差，尽管恒温扩增不需要PCR仪器，但结果显示大多数LAMP实验仍然需要PCR仪器保温，另外由于没有封闭系统，容易污染造成假阳性；在先申请CN201310052271公开了一种兔出血症病毒RT-PCR检测方法，在先申请CN200610042409公开了一种兔病毒性出血症病毒荧光定量检测方法，这两种方法操作简单，检测率高，敏感但是这些技术都需要专用的PCR仪、荧光PCR仪等特殊仪器设备，限制了在基层和普通实验室检测工作的开展。另外尽管之前也有针对RHDV特异性抗体的间接ELISA诊断试剂盒的研制，但市场上稳定高效简便的商品化检测试剂盒仍然极少，另外受感染兔有时表现耐受免疫，体内抗体滴度低等现象，因此，针对抗原检测的诊断方法更具有实际意义。

双抗夹心ELISA检测方法由于其高效、敏感、特异性，而且操作简单、适宜于基层和大批样品检测等特点，已经成为国内外动物疫病常用的疾病诊断技术。尽管目前双抗夹心ELISA已应用于牛病毒性腹泻病毒，甲型H1N1猪流感病毒等多种病院的检测，但是由于应用于建立双抗夹心ELISA方法的抗体多为一种单抗与一种多抗，而多抗效价低，敏感性差，假阳性高，并且不稳定，之前报道的实验室制备的针对VP60单克隆抗体之间没有良好的配对反应，因此该技术未应用于RHDV的检测。随着我国养兔业越来越发达，养殖规模不断扩大，建立一种良好稳定而且快速的适合于基层和临床检测RHDV的方法势在必行，我们期望通过制备一种稳定，敏感性高的检测RHDV的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、灵敏度高、特异性强、低成本、适应大规模检测的单克隆抗体介导的双抗夹心ELISA方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供一种适用于检测兔出血症病毒的双抗夹心ELISA方法的单克隆抗体9H9，通过如下方法筛选得到：

免疫原制备：纯化的VP60蛋白与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，制备免疫原，免疫小鼠；

阳性杂交瘤细胞制备：取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，间接ELISA筛选得阳性杂交瘤细胞；

单克隆抗体：阳性杂交瘤细胞亚克隆建株，腹水制备、纯化，即得7株单克隆抗体4A5，5B7，6F6，9H9，11D4，15C3，16F2；对所述7株单克隆抗体进行HRP标记；