[发明专利]一种用于诱导外周血单个核细胞产生细胞因子的结核分支杆菌融合蛋白

说明书

本发明公开了一种用于诱导外周血单个核细胞产生细胞因子的结核分支杆菌融合蛋白。本发明的融合蛋白，包含CFP‑10、EsxG和EsxH三个蛋白，蛋白之间通过连接肽连接。本发明提供的融合蛋白与现有的刺激物相比，其作用更高效、敏感性更强、特异性更高、刺激效果好。同时，本发明融合蛋白刺激PBMC 产生大量结核杆菌抗原特异性的 IFN‑γ、IL‑2、TNF‑α等结核相关因子，且这一刺激诱导反应不受卡介苗的干扰。本发明将更有效的提高结核病的检出率，对结核病的控制具有积极的意义。本发明的融合蛋白作为刺激物，可应用于结核病致病及免疫预防机制的研究，以及进一步的对结核病的控制中。

技术领域

本发明属于分子生物学技术中的蛋白领域，具体涉及一种用于诱导外周血单个核细胞产生细胞因子的结核分支杆菌融合蛋白。

背景技术

结核病(tuberculosis,TB)是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵及许多脏器，以肺部结核感染最为常见。全世界约有1/3的人口感染结核杆菌，每年新发结核病人约900万，每年约有300万人死于结核病，结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。根据世卫组织2014年10月22日出版的《2014年全球结核病报告》显示，2013年有900万人染上结核病，150万人死亡，约95%的结核病死亡发生在低收入和中等收入国家。中国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。结核病的传染主要是发生在病人未被发现并进行治疗之前，1名结核病患者平均可传染15人。因为在未发现患病前，新发病人没有采取任何预防手段，在与家庭成员、同事、同学等密切接触的过程中，接触者就容易被结核菌感染。

结核分枝杆菌是一种典型的胞内感染菌，人体对其免疫机制主要是以T细胞为主的细胞免疫。结核分枝杆菌侵入呼吸道后，原肺泡中未活化的树突状细胞（Dendriticcells, DC）抗菌活性弱，不能防止所吞噬的结核分枝杆菌生长，但可将结核分枝杆菌吞噬并带到他处，提呈抗原，使周围T淋巴细胞致敏，致敏的T淋巴细胞可产生多种细胞因子（INF-γ、IL-2与TNF-α等），这些细胞因子共同作用，杀死病灶中的结核分枝杆菌。根据这一免疫机制，通过对已感染结核分枝杆菌的患者及健康人血液中的细胞因子进行分析对比，发现感染结核分枝杆菌的患者其血液中INF- γ、IL-2、TNF-α的浓度明显升高。

对于已经感染了结核分支杆菌的患者，当已经过免疫的的特异性淋巴细胞在再次接触结核杆菌时，仍然会分泌相应的细胞因子。为研究结核分枝杆菌的致病机制及免疫机制，研究人员使用体外诱导PBMC产生结核相关细胞因子的方式。外周血是人类免疫系统研究的主要对象，其中体外诱导外周血单个核细胞PBMC包括淋巴细胞（T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞）、单核细胞和树突状细胞。将已经感染了结核分枝杆菌的患者的外周血采出，提取其中的PBMC，并采用结核相关抗原对其进行刺激，PMBC即可对抗原发生免疫反应，产生相应的细胞因子。由于直接使用结核分枝杆菌进行实验具有相当的危险性，不利于进行大量研究，因此研究人员采用提取的结核分枝杆菌抗原蛋白进行研究实验。

结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）是从结核分枝杆菌培养滤液中获得的活性物质，其主要成分是蛋白质。PPD可以刺激T细胞产生IFN-γ、IL-2等细胞因子，但对于已经经过卡介苗（BCG）免疫个体的样本，PPD同样能够刺激其提取出来的PBMC产生结核相关细胞因子，因此PPD的特异性较低，还需寻找特异性更好的刺激物。

发明内容

为了解决上述问题，寻找特异性更好的刺激物，本发明的目的在于提供一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的融合蛋白以及应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种融合蛋白，包含CFP-10、EsxG和EsxH三个蛋白，蛋白之间通过连接肽连接。

优选的，连接肽氨基酸序列为GGGGSGGGSGGSGS（SEQ ID NO：3）。