[发明专利]一种基于CRISPR/Cas系统的多年生黑麦草的育种方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas系统的多年生黑麦草的育种方法，其特征在于：包括下列步骤：

(1)、筛选功能基因，所述功能基因为木质素合成的关键酶基因LpCCR和LpCOMT；

(2)、优化酿脓链球菌Cas9基因，并在基因编码序列的两端分别添加NLS核定位信号和限制性内切酶位点；

(3)、用限制性内切酶酶切优化的Cas9基因，得到基因片段，连入载体，得到重组质粒pA；

(4)、扩增多年生黑麦草的U3或U6RNA启动子，连接在gRNA骨架序列前，将U3或U6启动子和gRNA构建在pB载体上；

(5)、设计并合成带有粘性末端的靶位点引物，连接于pB载体上；

(6)、以黑麦草幼苗为起始材料，采用纤维素酶R-10和离析酶R-10，对黑麦草叶肉组织进行消化并利用密度梯度沉降的方法分离原生质体，获得高纯度的原生质体；

(7)、通过PEG介导法将目的基因导入黑麦草原生质体基因组中，通过后续原生质体基因组DNA提取，进行酶切和测序，检测构建载体pA、pB的活性。

(8)、选择高表达的靶位点引物进行遗传转化，在T0代转基因植株中筛选功能基因敲除的突变体；

(9)、在后代中筛选纯合突变体以及pA、pB质粒整合位点和靶基因位点不在同一染色体上的品系；

(10)、将步骤(9)筛选得到的纯合突变体和所述品系进行回交转育，得到木质素含量降低的多年生黑麦草品系。