[发明专利]一种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA测定技术领域，具体是一种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法。

背景技术

血液循环DNA(CirculatingDNA，ctDNA)，又称游离DNA或无细胞DNA(Cell-freeDNA)，主要来源于细胞的凋亡和死亡。可作为肿瘤、自身免疫病及胎儿遗传学检测的依据。目前的检测方法均需要先从血清或血浆中提取DNA，然后扩增基因组中某个基因的方式，计算ctDNA的浓度或基因组拷贝数。由于个体间、不同病理状态间ctDNA含量及片段完整程度存在较大差异，即便不考虑操作者的因素，所用提取方法和试剂的不同就会造成提取效率存在巨大差别。在此基础上的ctDNA测定结果误差会更大。但直接用血浆或血清扩增，血清或血浆中含有的蛋白质等会严重干扰PCR，使标本间的扩增效率不一致。此外以SYBRGreen为染料的定量PCR技术存在荧光染料信号强度低，灵敏度不高，对于低拷贝数的模板不容易检测到。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度高、操作简便的快速准确的定量测定血液循环DNA的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法，具体步骤如下：

(1)血浆或血清的处理：取外周静脉血置于EDTA抗凝管中室温静置或取自凝全血，1800-2200g离心力下离心4-6min，取上层血浆，加入相同体积的稀释试剂，混匀，在92-97℃下搅拌6-10min，再在15000-17000g离心力下离心8-12min，取上清液为模板做PCR；

(2)配置定量PCR反应体系：快速复活热启动DNA聚合酶、SuperGreen染料和2x混合物，所述2x混合物包括2x反应缓冲液、终浓度为3mM的氯化镁和三磷酸脱氧核苷，所述三磷酸脱氧核苷包括dATP，dCTP，dGTP和dTTP，所述dATP，dCTP，dGTP和dTTP的终浓度均为0.35-0.45mM；

(3)定量PCR反应：用于ROCHE、ABI定量PCR设备，在92-98℃下反应4-6min；92-98℃下反应4-6s，55-65℃下反应18-22s，70-74℃下反应18-22s，重复45个循环。

作为本发明再进一步的方案：所述自凝全血中无添加剂或自凝胶。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过对血浆或血清进行处理，可以直接用血浆或血清进行定量PCR反应，不影响PCR反应，扩增效率与提纯DNA相比一致，减少了DNA提取步骤和实验误差，采用新的荧光染料SuperGreen，对PCR扩增过程中的抑制作用更轻微，可使用较高浓度，荧光信号值高、反应灵敏度高，可精确检测出低至纳克水平的血浆游离DNA，试剂价钱便宜，减少了使用DNA提取试剂盒的费用，操作简便，可用于大规模肿瘤高危人群筛查、肿瘤的早期诊断及疗效预后的动态观察。

附图说明

图1为本发明实施例4中患者标准量ctDNA的PCR扩增后的荧光信号分析示意图。

图2为本发明实施例4中ctDNA含量与荧光强度的相关性曲线示意图。

图3为本发明实施例5中患者标准量ctDNA的PCR扩增后的荧光信号分析示意图。

图4为本发明实施例5中ctDNA含量与荧光强度的相关性曲线示意图。

图5为同一个ctDNA使用不同荧光染料进行PCR扩增后的荧光信号分析示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

一种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法，具体步骤如下：

(1)血浆或血清的处理：取外周静脉血置于EDTA抗凝管中室温静置或取自凝全血，1800g离心力下离心4min，取上层血浆，加入相同体积的稀释试剂，混匀，在92℃下搅拌6min，再在15000g离心力下离心8min，取上清液为模板做PCR；

(2)配置定量PCR反应体系：快速复活热启动DNA聚合酶、SuperGreen染料和2x混合物，所述2x混合物包括2x反应缓冲液、终浓度为3mM的氯化镁和三磷酸脱氧核苷，所述三磷酸脱氧核苷包括dATP，dCTP，dGTP和dTTP，所述dATP，dCTP，dGTP和dTTP的终浓度均为0.35mM；

(3)定量PCR反应：用于ROCHE、ABI定量PCR设备，在92℃下反应4min；92℃下反应4s，55℃下反应18s，70℃下反应18s，重复45个循环。