[发明专利]在胞内环境中表现出增强的稳定性的免疫球蛋白构架及其鉴定方法

说明书

本申请是2003年5月21日提交的同名发明专利申请03814626.6、201010575786.1及20141003195.3的分案申请。

【发明领域】

本发明涉及蛋白质化学、分子生物学以及免疫学。

【相关技术领域背景】

抗体能以高度的特异性和亲和力识别并靶向几乎任何分子。这个特点已被开发，以便将这些天然蛋白转变为用于诊断和治疗应用的强有力的工具。重组DNA技术的进展已推动了抗体基因在广泛种类的非淋巴细胞中的操作、克隆和表达(Skerra,1988；Martineau,1998；Verma,1998)。已经构建了许多不同的抗体片段，以便最佳地满足各种应用。保留整个母体免疫球蛋白全部抗原结合能力的最小实体是单链Fv片段(scFv)(Bird,1988)。该抗体片段包含由柔性肽接头连接起来的重链和轻链可变区，这使得该蛋白能够由单个基因表达。

抗体片段较之于完整免疫球蛋白分子具有若干重要的优势。由于分子小，它们在多种表达宿主细胞如大肠杆菌细胞中的表达得以易化、且产量得以提高(Plückthun,1996)。而且，抗体片段允许在体内应用中改善肿瘤穿透力(Yokota,1992)，并且它们能够与多种用于治疗途径的效应分子共价连接。

天然存在的抗体是由浆细胞分泌的，已进化至能够在胞外氧化环境中行使功能。为获得其功能性折叠结构，它们通常需要在不同结构域内形成二硫键，这对于免疫球蛋白折叠是至关重要的。与全长抗体形成对照，scFv或Fab抗体片段原则上能够在任何细胞内部的还原环境中功能性地表达，并定向到任何区室，以靶向胞内蛋白，从而引发特定的生物学效应(Biocca,1991)。的确，有些称之为内体(intrabodies)的胞内单链抗体片段，已被成功地用于调节不同的生物系统中胞内靶蛋白的功能。从而，针对病毒侵染的抗性已在植物生物技术中得到展示(Tavladoraki,1993；Benvenuto,1995)，内体与HIV蛋白的结合业已证明(Rondon,1997)，并且与癌基因产物的结合(Biocca,1993；Cochet,1998；Lener,2000)也已有描述。而且胞内抗体在表征目前通过人类基因组测序鉴定到的大量基因的功能方面有希望成为有价值的工具(Richardson,1995；Marasco,1997)。例如，它们可在功能基因组途径中用于封闭或调节新近鉴定的蛋白的活性，由此促成对其功能的了解。最后，内体具有诊断和治疗应用的潜力，例如在基因治疗环境中。

尽管存在极大的前景，功能性内体的产生仍然受限于其不稳定性和不可溶性或者聚集的倾向。胞浆的还原环境防止形成保守的链内二硫桥，从而使得高百分比的抗体片段不稳定，因此在细胞内无功能(Biocca,1995；Proba,1997)。抗体片段的稳定性和可溶性因此构成了内体在体内作为潜在的蛋白功能调解剂的应用的主要障碍。迄今为止，尚不可预言使得抗体片段在胞内环境中具备功能的序列要求。

因此，急需在广范围的不同细胞类型中性能良好的抗体片段，从而可作为用于多种结合特异性的构架。此类构架可用于构建用于胞内筛选的文库，或者可作为既有抗体结合部分的受体。

除了独特地满足胞内应用之外，在众多的胞外和体外应用中，基于极为稳定的可变结构域构架的此类抗体片段或完整抗体相比于其它抗体也具有独特的优势。当此类构架在氧化环境中产生时，其二硫桥能够形成，进一步增强其稳定性，并使得它们高度抵抗聚集和蛋白酶降解。体内半衰期(及针对聚集和血清蛋白酶降解的抗性)是除了亲和力和特异性之外的、使抗体在治疗或诊断应用中成功的唯一最为重要的因素(Willuda,1999)。抗体片段的半衰期可通过共价连接聚合物分子如聚乙二醇(PEG)而进一步得以提高(Weir,2002)。这类稳定分子代表了抗体应用的显著进步，尤其但并不仅当不期望F_C功能时。

抗体片段文库极大的实践重要性激发了该领域的研究。Winter(EP0368684)提供了抗体可变区基因的初始克隆和表达。由这些基因出发，他建立了在互补决定区(CDR)以及构架区具有高度多样性的巨大抗体文库。不过，Winter未披露不同构架用于文库构建的用途。

另一方面，Plückthun(EP0859841)教导试图通过将构架限于有限数目的合成共有序列而改进文库设计。包括引入大量合理设计的突变的蛋白质工程的努力以前就提示针对相应共有序列的突变是提高分离的可变免疫球蛋白结构域稳定性的合适手段(Ohage1999；Ohage1999以及US5,854,027,特此并入作为参考)。