[发明专利]一种促进利福霉素SV发酵合成效率的补料方法

说明书

本发明公开了一种促进利福霉素SV发酵合成效率的补料方法。三级发酵培养地中海拟无枝酸菌周期为48‑72 h时，开始向发酵培养物内无菌流加乙醛溶液，至发酵结束前10 h停止流加，使乙醛终浓度为1.5‑3.0 mmol/L。培养结束时利福霉素SV效价平均提高10.1%。该新方法具有操作简单、利福霉素SV增产效果稳定等特点。

技术领域

本发明涉及一种促进利福霉素SV发酵合成效率的补料方法。本发明属于生物制药发酵工程领域，特别是涉及一种发酵过程调控胞内NADH的氧化方向迁移及效率、改善碳、氮代谢流分配、促进利福霉素SV的核心氮环前体3-氨基-5-羟基苯甲酸的生成，提高利福霉素SV合成效率的方法。

背景技术

做为结核病治疗的大宗抗生素原料药，提高利福霉素发酵合成效率一直备受生产企业和研究单位关注。目前，国内关于提高利福霉素发酵效价的报道较多，包括：生产菌种的分子生物学信息特征、发酵培养基优化等方面，如对比文献1：在摇瓶水平添加豆油和丙氨酸可提高利福霉素SV效价12.3％(食品与发酵工业，商纯良，2011，37(5)：56-60)；对比文献2：在50吨大罐水平添加豆油和乙二酸可使利福霉素SV发酵十亿提高5.4％(发明专利ZL201210176175.9)；对比文献3：添加丙氨酸、豆油和磷霉素钠/磷霉素氨丁三醇可使利福霉素SV效价平均提高17.0％(发明专利申请号201210176177.8)。对比文献4：在10L发酵罐培养地中海拟无枝酸菌过程中基料添加锌离子(终浓度0.75mg/L)对利福霉素SV效价和有机酸合成产生了显著影响(中国酿造，邓鹏飞，2013,32(8)：84-87)。但是，对比文献1只涉及豆油和丙氨酸存在交互作用，在确定的优化浓度下，利福霉素SV效价提高12.3％，并对生产菌种的糖酵解途径碳代谢、有机酸合成效率以及效价合成的影响进行了初步的分析，并没有涉及发酵过程中NADH的氧化方向迁移和效率对利福霉素SV合成的影响；对比文献2涉及豆油和乙二酸的双重作用调节三羧酸循环中的关键步骤---琥珀酸脱氢酶催化的反应的活性，通过促进利福霉素SV前体---甲基丙二酰CoA的合成代谢效率来提高利福霉素SV的合成效率，也没有涉及发酵过程中NADH的氧化方向迁移及效率对利福霉素SV合成的影响；对比文献3仅初步说明了三者具有调节利福霉素SV发酵的作用，而且该文献也没有涉及发酵过程中NADH的氧化方向迁移和效率对利福霉素SV合成的影响；对比文献4通过分析胞外部分有机酸、氨基酸的变化规律，报道锌离子通过抑制丙氨酸脱氢酶活性并引起丙酮酸积累，使由草酰乙酸衍生的赖氨酸和由α-酮戊二酸衍生的谷氨酸合成量增大，促进了利福霉素SV的合成。但是，对比文献4并没有涉及发酵过程中NADH的氧化方向迁移和效率对利福霉素SV合成的影响。

氧化还原反应几乎参与到微生物细胞生长和代谢的各个环节，在有氧呼吸条件下，NADH经电子传递链氧化为NAD⁺，并产生大量ATP，为细胞生命活动和产物的合成提供能量。但在发酵条件下电子传递受到限制，并引起碳代谢途径发生改变。细胞生长代谢过程中糖酵解途径(EMP)和三羧酸循环(TCA)会大量产生NADH，在发酵条件下细胞若不能很好的将NADH经电子传递链或一些脱氢酶催化的反应(如：丙氨酸脱氢酶)氧化，就会出现NADH/NAD⁺比例失衡。这必然会影响细胞的生理代谢和次级代谢物的积累。利福霉素SV的氮环前体(3-氨基-5-羟基苯甲酸)合成效率与谷氨酰胺合成酶(GS)的活力密切正相关并受丙氨酸(Ala)抑制，而发酵条件下细胞通过丙氨酸脱氢酶氧化NADH生成Ala，该途径流量增强会抑制GS活性以及3-氨基-5-羟基苯甲酸的合成效率。因此，若能改变发酵条件下NADH的氧化方向以及效率，即：降低NADH经丙氨酸脱氢酶催化途径碳流量，则既能使发酵条件下NADH/NAD⁺处于失衡状态，又能降低Ala的积累，使GS活性维持在较高水平，从而促进3-氨基-5-羟基苯甲酸和利福霉素SV的合成效率。因此，发酵条件下选择细胞合适的受氢体可能会实现上述目的。