[发明专利]一种葡萄糖基转移酶基因及其制备方法和重组工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于酶的基因工程和酶的生化工程领域，涉及一种野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonascampestrispv.campestris）的葡萄糖基转移酶的序列，涉及含有该酶基因的制备方法、重组工程菌和应用。

背景技术

熊果苷(Arbutin)化学名称为对-羟基苯-D-吡喃葡萄糖苷，最早发现于熊果叶中，其有两种差向异构体，即α和β型熊果苷。熊果苷最初应用于药物中，有抗菌、消炎、利尿、镇咳的作用。自上世纪80年代，研究发现熊果苷作为酪氨酸酶的竞争抑制剂，能抑制黑素形成过程中关键酶酪氨酸酶的活性，因此有美白的效果。日本资生堂公司首先将熊果苷应用于美白化妆品中，目前国内外也有多家厂商将熊果苷添加美白类化妆品中。故熊果苷有很大的市场应用前景。

通过相关研究发现，β-熊果苷在β-葡萄糖苷酶的作用下可转化为氢醌，而氢醌因具有潜在的致敏性和致癌性，除美甲和染发类化妆品外，在其他化妆品中为禁用物质。相对于β-熊果苷，α-熊果苷具有更好的生物稳定性和美白活性，由于其抑制酪氨酸酶的原理的差异，导致α-熊果苷的美白效果是β-熊果苷的15倍。按照目前的技术，β-熊果苷几乎都是由化学法合成，而α-熊果苷仅限于通过生物转化法合成。

随着基因工程技术的发展，通过克隆葡萄糖基转移酶基因实现其在大肠杆菌中的过量表达，这样可以降低生产周期，提高生产效率，更加有利于工业化生产。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种葡萄糖基转移酶基因及其制备方法，本发明的第二个目的是提供所述基因的重组工程菌和其应用。本发明运用基因工程技术，将野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中的葡萄糖基转移酶基因进行克隆，并导入大肠杆菌中进行重组表达，从而提供一种高效、绿色、安全、低成本的一步法催化对苯二酚生产α-熊果苷的方法。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

本发明提供了一种葡萄糖基转移酶基因，所述的葡萄糖基转移酶基因是从野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonascampestrispv.campestris）中克隆而来，所述的葡萄糖基转移酶核苷酸序列为SEQIDNo.1。

本发明提供了一种葡萄糖基转移酶基因，所述的葡萄糖基转移酶核苷酸序列为SEQIDNo.1，其命名为agl，全长为1617bp，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQIDNo.2，蛋白质的氨基酸数为538个氨基酸。

本发明还涉及从NCBI数据库上获得葡萄糖基转移酶基因的序列，并设计引物。由于实验采用一步法克隆试剂盒（OneStepCloningKit）进行克隆，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。其引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列（15-20bp）。

作为优选，按如上方法设计引物为:agl-one-step-F：5’-GAAGGAGATATACCATGTCGCAGACACCATG-3’；agl-one-step-R:5’-AGTGCGGCCGCAAGCTTCAGCCACGACCGAC-3’。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

上述的葡萄糖基转移酶基因的重组工程菌。

本发明以Xcc基因组DNA为模板，通过引物退货温度优化获得一个最佳的退火温度，PCR获得葡萄糖基转移酶基因。同时本发明要对载体进行线性化处理，按照操作说明，采用双酶切线性化，因为该法线性化完全，转化背景低。上述的重组工程菌的构建方法，该重组工程菌的载体用NdeⅠ和HindⅢ双酶切线性化后，将两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化载体按一定比例混合后，在重组酶Exnase的催化下，在37℃下反应30min重组完全，完成定向克隆。

所述葡萄糖基转移酶基因重组工程菌的构建，本发明所述的重组表达载体通过本领域一种最新技术将本发明的葡萄糖基转移酶基因连接于各种表达载体上构建而成。实验室常用的载体有pMD19-T、pUCM-T、pET20b、pET22b、pET28a、pET32a等。本发明考虑到目的基因的表达严谨性，选择pET28a作为重组载体。