[发明专利]一种花生高油酸回交育种后代基因型的快速精准鉴定方法

权利要求书

1.一种花生高油酸回交育种后代基因型的快速精准鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）回交育种后代花生种子子叶薄片样品的获取：用刀片从远胚根端在子叶上切取薄片组织，加入钢珠、液氮冷冻后，立即研磨得到花生种子子叶薄片样品；

花生种子子叶薄片样品的DNA提取；采用CTAB法提取花生种子子叶薄片样品的基因组DNA；

（2）以提取的基因组DNA为模板，采用特异性引物进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；所述特异性引物的引物序列为：F0.7：5-CACTAAGATTGAAGCTC-3；

R3：5-CCCTGGTGGATTGTTCA-3；以R3：5-CCCTGGTGGATTGTTCA-3为测序引物，对PCR扩增产物进行直接测序；

（3）根据测序峰图判定回交育种后代花生种子的基因型。

2.根据权利要求1所述花生高油酸回交育种后代基因型的快速精准鉴定方法，其特征在于，所述根据测序峰图判定回交育种后代花生种子的基因型的具体判断方法为：（1）首先确认测序峰图上在Fad2A和Fad2B基因之间的SNP位点ORF432bp产生C/A套峰、在Fad2A和Fad2B基因之间的SNP位点ORF465bp产生A/G套峰、在Fad2A和Fad2B基因之间的SNP位点ORF528bp产生C/T套峰、或在Fad2A和Fad2B基因之间的SNP位点ORF534bp产生C/T套峰，来确认扩增产物中同时存在Fad2A基因和Fad2B基因的序列产物；（2）然后根据测序峰图，在Fad2A/2a基因的SNP位点ORF448bp上，若存在G/A套峰，基因型判定为Aa，若不存在G/A套峰则基因型判定为AA；在Fad2B/2b基因的SNP位点ORF442bp上，若存在A插入引起的测序迭峰，基因型判定为Bb，若不存在A插入引起的迭峰则基因型判定为BB；（3）根据步骤（2）的判断结果，最终判定回交育种后代花生种子的基因型为AABB、AABb、AABB或AaBb。

3.根据权利要求1所述花生高油酸回交育种后代基因型的快速精准鉴定方法，其特征在于，所述CTAB法提取花生种子子叶薄片样品的基因组DNA的具体操作方法为：（1）在花生种子子叶薄片样品中加入400μLCTAB提取缓冲液，在55~65℃水浴锅中水浴20-30min；（2）加入200μL苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的混合溶液，充分振荡混匀后室温静置10min；（3）12000rpm离心10min，离心后取上清液，加入等体积氯仿：异戊醇=24：1的混合溶液，振荡混匀后12000rpm离心10min，取上清液再加入等体积异丙醇或2.5倍体积无水乙醇，-20℃静置30min以完全沉淀DNA；（4）12000rpm离心30min后弃上清，白色沉淀用75%酒精洗2-3遍；在超净工作台上风干残留的酒精，白色沉淀用50-100μL1*TE或蒸馏水溶解。