[发明专利]检测百菌清的时间分辨荧光免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体的说，涉及一种检测百菌清的时间分辨荧光免疫分析试剂盒。

背景技术

百菌清是具有高温选择性的水稻田专用除草剂。对水稻安全，杀草谱广。杂草种子在发芽过程中吸收药剂，根部吸收较差。该品为芽前除草剂，主要用于防除禾本科杂草。产品属2-氯化乙酰替苯胺类除草剂，是细胞分裂抑制剂，用于土壤处理可防除稻田稗草、异型莎草、牛毛毡、鸭舌草、窄叶泽泻等。具有一定的毒性，因此安全问题受到高度重视。国标中规定小麦中为0.1 mg/kg。因此定期对百菌清残留进行检测成为许多国家的监控的必要手段。

百菌清残留分析一般使用气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）及气相色谱质谱联用技术（GC/MS），这些方法灵敏、准确，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器，样品前处理复杂、繁琐费时、检测成本较高，而且需专业人员操作，很难满足对样品进行现场、批量、快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适用于农药残留现场监控的分析方法具有重要的现实意义。

而时间分辨荧光免疫分析法（TR-FIA）由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对百菌清检测的时间荧光免疫分析法的专利和文献报道。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种蔬菜水果中百菌清残留的检测时间分辨荧光免疫分析试剂盒。

本发明的目的之二在于提供一种快速简便地检测蔬菜水果中百菌清的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，用于定量或定性地检测农作物中百菌清残留量。

本发明目的之一是这样实现的：检测百菌清的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其关键在于由多孔包被板、缓冲液、百菌清标准品溶液、抗百菌清的抗体冻干品、铕标记的兔抗鼠抗体、洗涤液和增强液体所组成。

本发明目的之二是这样实现的：检测百菌清的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理及检测，其关键在于：

(1) 免疫原的制备：将半抗原百菌清与牛血清白蛋白（BSA）偶联，得到免疫原（百菌清-BSA）；

(2) 包被原的制备：将半抗原百菌清与卵血清白蛋白（OVA）偶联，得到包被原（百菌清-OVA）；

(3) 单克隆抗体的制备：

a. 用步骤(1)的免疫原（百菌清-BSA）免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗百菌清的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

b. 以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗百菌清的单克隆抗体IgG；

c. 用步骤(2)的包被原包被96孔包被板；

(4) 样品的前处理及检测：

取包被有包被原（百菌清-OVA）的多孔包被板，加入50 µL的百菌清到各自的微孔中，加50 µL以缓冲液稀释的抗百菌清抗体，25℃～37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗3次，加以缓冲液稀释的100 µL Eu³⁺ -兔抗鼠抗体，25℃～37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗6次，加200 µL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，根据标准曲线计算样品中的百菌清含量。

上述的固相载体是多孔包被板，采用96孔的多孔包被板作为固相载体。

本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析方法来检测百菌清。采用时间分辨荧光免疫分析法的技术主要有两个方面：第一，特异性单克隆抗体制备，用偶联的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗百菌清的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗百菌清的单克隆抗体IgG。第二，Eu³⁺标记抗体的制备。

本发明测定方法：测定的基础是标记免疫反应。包被有百菌清-OVA的多孔包被板，加入测试样品到各自的微孔中，再加入抗百菌清抗体，振荡反应，游离的百菌清与微孔板上的百菌清-OVA竞争抗百菌清抗体，洗涤液洗涤，没有连接的百菌清抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu³⁺-兔抗鼠抗体,进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的Eu³⁺-兔抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外灯的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中百菌清的量。