[发明专利]促进真皮乳头细胞生长的组合物及其医药组合与制备方法

说明书

技术领域

本发明关于一种用于促进真皮乳头细胞(dermalpapillacell)生 长的组合物的制备方法，尤指一种由脐带组织的类纤维母细胞经培养 而获得含有特定组份的组合物的制备方法；本发明亦关于一种促进真 皮乳头细胞生长的组合物，其具有促进真皮乳头细胞增生的效果。本 发明亦关于一种包含有效剂量的前述组合物的医药组合，以达到促进 真皮乳头细胞生长的效果。

背景技术

现有技术中，藉由培养上皮细胞和间质干细胞等方式获得干细胞 因子(stemcellfactor，SCF)、血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowthfactor，VEGF)、表皮生长因子(epidermalgrowth factor，EGF)和类胰岛素生长因子(insulin-likegrowthfactor，IGF) 等生长因子，其缺点在于一般冷冻需渐进降温，较为耗时，且在后续 培养过程中，培养基所含的盐类会造成对皮肤毛发的刺激性。

发明内容

鉴于现有技术未使用冻融循环方式而导致产量较低、且无同时进 行浓缩与去盐类步骤以及整体步骤较为繁复耗时等缺点，本发明的目 的在于提供一种促进真皮乳头细胞(dermalpapillacell)生长的组合 物的制备方法，该方法通过液态氮冷冻解冻循环方式破坏细胞并收集 细胞裂解液(celllysate)，以获得更多的多肽混合物(polypeptideor proteincocktail)，并经由浓缩去盐以获得特定分子量的组合物。

为达上述目的，本发明提供一种促进真皮乳头细胞生长的组合物 的制备方法，其包含：提供猪脐带(umbilicalcords)组织；以冲洗液 冲洗该猪脐带组织，使血球细胞和体液从猪脐带组织中移除；由猪脐 带组织分离细胞并进行继代培养以获得细胞激素；将细胞及细胞激素 进行冻融循环至少2次，以获得多肽混合物；以及将该多肽混合物浓 缩去盐，以获得组合物，其中该组合物的分子量大于3000道尔顿 (dalton,Da)。

依据本发明，“冲洗液”如此处所述指对于猪脐带组织为等张的溶 液；优选的所述冲洗液为90％氯化钠溶液或磷酸盐缓冲溶液(phosphate bufferedsolution，PBS)。

依据本发明，“分离细胞”如此处所述指将猪脐带切成非常小的碎 片以形成脐带碎片，并将4块至6块脐带碎片放置于培养皿中，其培 养皿中包括10毫升(ml)的生长培养基(含有α-MEM以及10％胎牛血清 (fetalbovineserum，FBS))，置于恒温容器培养10天后去除脐带碎 片，且每周加两次3ml培养基，其中恒温容器指二氧化碳(CO₂)培养箱 (含有5％CO₂)，以获得细胞。

依据本发明，“继代培养”如此处所述指当细胞生长至高密度时， 即进行收集细胞，并经稀释后分殖至新的培养皿中，以降低细胞密度 并维持细胞生长，其稀释比例依细胞种类而异。

依据本发明，“冻融循环”如此处所述指将细胞及其细胞激素放置 于液态氮中冷冻，然后再将细胞取出至室温中融化，反复多次而达到 破坏细胞膜的效果。如本案所例示，将含有细胞的冷冻管直接浸置于 液态氮中，再将含有细胞的冷冻管由液态氮中取出置于37℃水浴解 冻，重复以上步骤循环至少2次，并将破裂的细胞于1000G离心15 分钟至20分钟。

依据本发明，“浓缩去盐”如此处所述指将多肽混合物放置于过滤 装置中，并经由离心及去除上清液，使多肽混合物达到浓缩并去除盐 类的效果。如本案所例示，将多肽混合物置于超滤装置或离心设备， 以减少多肽混合物的体积、增加浓度以及去除杂质(如盐类)，从而获 得组合物，其中该组合物的分子量大于3000道尔顿(dalton,Da)。

优选的，所述组合物包含一种或多种选自于由血管生成素 (angiogenin)、血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowth factor，PDGF)、纤维母细胞生长因子7(fibroblastgrowthfactor7， FGF7)及其组合所组成的组。

优选的，在所述的由猪脐带组织分离细胞并进行继代培养以获得 细胞激素的步骤中，将分离所得的细胞置于不含血清的培养基培养3 天至18天，以获得细胞激素。