[发明专利]检测恶喹酸的时间分辨免疫荧光试剂盒制备方法和应用

权利要求书

1.一种检测恶喹酸的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分:

包被羊抗恶喹酸多克隆抗体的酶标板；

斓系元素标记的恶喹酸单克隆抗体标记物；

恶喹酸单克隆抗体校准品；

清洗液；

分析液；

增强液。

2.根据权利要求1所述的一种检测恶喹酸的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述羊抗鼠多克隆抗体的包被浓度为1-100μg/ml。

3.根据权利要求1所述的一种检测恶喹酸的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述镧系元素标记的羊抗鼠单克隆抗体标记物中抗体是恶喹酸单克隆抗体，所述标记示踪物是镧系元素金属离子及其鳌合物中的一种，包括铕Eu,铽Tb,钐Sm和镝Dy。

4.根据权利要求1或2所述的一种检测恶喹酸的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述镧系元素标记的恶喹酸单克隆抗体标记物中镧系元素离子与恶喹酸单克隆抗体的摩尔比例是6-10:1。

5.一种权利要求1所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:

步骤1.羊抗鼠多克隆抗体包被酶标板的制备:将羊抗鼠多克隆抗体在包被液中透析，用包被液将羊抗鼠多克隆抗体稀释到1-100μ g/ml，然后包被到96孔酶标板中，再用封闭保护液封闭，最后甩干封闭保护液干燥密封备用；

步骤2.镧系元素标记的恶喹酸单克隆抗体标记物的制备: 将恶喹酸单克隆抗体用标记液进行透析，取透析好的恶喹酸单克隆抗体加入到镧系元素离子或其鳌合物中进行标记，然后纯化，收集标记物；

步骤3.恶喹酸单克隆抗体校准品的制备:用恶喹酸单克隆抗体和PBS配制浓度为0.1,0.5,1.0,2.0,5.0和l0ng/ml的恶喹酸单克隆抗体校准品；

所述清洗液、分析液和增强液为市售商品。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述取透析好的恶喹酸单克隆抗体加入到镧系元素离子中进行标记，所述镧系元素离子与恶喹酸单克隆抗体的摩尔比例是6-10:1。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述的包被液采用如下方法制得:在900m1去离子水中依次加入35.08g Na₂HP0₄-12H₂0,15.91g NaH₂P0₄-2H₂0和9.00gNaCl，待完全溶解后用1N HCl或1N NaOH调整PH值至6.8±0.10。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述的封闭保护液采用如下方法制得:将8.77g Na₂HP0₄·12H₂0和3.98g NaH₂PO₄·2H₂O加入到600m1去离子水中，再依次加入1g BSA,60g Trehalose和1g Diazolidinyl Urea，待完全溶解后调整PH值至6.8±0.1,定容到1L。

9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述的标记液采用如下方法制得:在900m1去离子水中依次加入2.12g Na₂CO₃和6.72g NaHCO₃，待完全溶解后用1M HCl或1MNaOH调整PH值至9. 2±0.2。

10.一种如权利要求1所述的试剂盒在定量检测恶喹酸中的应用，其特征在于，包括

如下步骤:

步骤1.待检样品的制备:将恶喹酸包被到固体载体上后，收集其废弃液，测量废弃液的体积并用分析液稀释作为待检样品；

步骤2.将恶喹酸单克隆抗体校准品和待检样品依次加入到羊抗鼠多克隆抗体包被的酶标板上，每个校准品和待检样品重复三孔，再加入分析液，震荡孵育；

步骤3.将清洗液用去离子水进行稀释，然后用已稀释的清洗液清洗酶标板多次并甩干；

步骤4.将纯化好的斓系元素离子标记的恶喹酸单克隆抗体，用分析液稀释，加入酶标板中，震荡孵育；

步骤5.用稀释的清洗液清洗酶标板多次并甩干；

步骤6.每孔加入增强液，在时间分辨荧光检测仪上按所编程序检测荧光信号；

步骤7.根据荧光数值建立标准曲线，将待检样品的荧光信号代入到标准曲线中，求得待检样品中恶喹酸的检测浓度，再按照公式“100%－废弃液中恶喹酸检测浓度*废弃液体积*稀释倍数/恶喹酸投入量*100%计算恶喹酸的包被率。