[发明专利]采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药、食品、保健品等行业领域，具体是一种同时测定具有生物活性的天然产物的HPLC方法，特别是涉及一种应用于HPLC中的波长转换技术，用于同时检测金银花中绿原酸，木犀草素，木犀草苷3种抗氧化活性成分。

背景技术

金银花是我国传统中药，为忍冬科忍冬属植物忍冬的干燥花蕾或待初开的花。其味甘，性寒，具有清热解毒、疏散风热，疏利咽喉、消暑除烦的作用，可治疗暑热症、泻痢、流感、疮疖肿毒、急慢性扁桃体炎、牙周炎等病。金银花主要含有挥发油、有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类、环烯醚萜苷类等生物活性成分。其中，以木犀草苷及其代谢前体木犀草素为代表的黄酮类化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌等多种药理作用。

目前天然产物的检测方法有很多，主要有:紫外分光光度法、可见分光光度法、二阶导数光谱法、系数倍率法薄层色谱扫描法(TLC法)、高效液相色谱法(HPLC法)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC法)、导数极谱法和HPLC法与其它方法的联用。目前,随着分析检测技术的快速发展,传统的检测方法比如薄层色谱、分光光度法等逐渐地被精确的检测方法所取代。高效液相色谱法、气相色谱法等已经成为主流的检测方法。这些方法相对于传统方法,能够检测到天然产物单体化合物的含量，得到的试验数据更精确。

绿原酸和木犀草苷是药材金银花中的代表性药效成分，中国药典2000年版公布了用高效液相法测定金银花中绿原酸含量的方法，2005年版新增并建立了用高效液相色谱法(HPLC法)来测定木犀草苷含量的标准方法，但由于绿原酸与木犀草苷分子结构差异较大，要采用不同的HPLC分析方法对两种物质含量进行分别测定，需要用到两种不同的色谱柱及检测条件，工作量大，测定时间长，不利于快速分析和大批量样品质量控制的需要。

中国发明专利201110031466.4提出一种HPLC波长切换同时测定白芍及炮制品中9种成分含量方法，该方法利用同一种检测条件和波长切换的方法，既可以达到增加质量覆盖面的目的，又可以保证每种成分在最大吸收波长处被检测，提高检测灵敏度。中国发明专利201210079072.0提出一种HPLC波长切换技术同时测定牡丹皮、大黄牡丹皮药对及含大黄牡丹皮药对的制剂中多种成分含量的方法，该方法利用多不同时间段的不同梯度洗脱条件以及不同的检测波长，可依次测定样品中1‐6种成分的含量。

发明内容

针对目前对于金银花中多种有效成分同时检测方法的存在空白缺失，以及HPLC检测方法在多种中药材成分检测中的应用现状，本发明提供一种灵敏度和精确度高，工作流程简便的采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法。

本发明建立一种基于HPLC的检测方法，首次提出基于HPLC转换波长技术及梯度洗脱技术应用于同时检测金银花中的3种标志性有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的方法。本发明方法根据金银花中3种有效成分分子性质的差异，运用HPLC梯度洗脱技术控制其洗脱时间，以及根据其分子结构及波谱性质差异，运用波长转换技术，达到同时检测的目的；采用梯度洗脱和检测器波长转换技术，通过调节色谱条件(流动相、柱温、流速、波长等)，实现金银花中绿原酸、木犀草素和木犀草苷3种抗氧化活性成分的同时定量检测。

本发明目的通过如下技术方案实现：

采用HPLC同时测定金银花及其植物中3种抗氧化活性成分含量的方法，包括如下步骤：

1)测试样溶液的配制：取干燥的金银花或其植物叶茎0.5～2.0g，切细并搅碎后放置容器中，加质量浓度为50～80％乙醇5～20ml，超声处理，过0.45μm的滤膜，添加乙醇定容，得测试样溶液；

2)测定金银花中3种有效成分绿原酸、木犀草素和木犀草苷的含量：取步骤1)的测试样溶液，上ODS色谱柱，梯度洗脱：洗脱液为乙腈与磷酸水的混合液，乙腈在所述混合液中的质量浓度为0.1～1.0％；流动相中乙腈的浓度梯度随时刻的变化情况如下：

(1)第一梯度，从起始时刻0min至时刻t₁，质量百分比计，乙腈由初始的C_A0上升到C_A1；t₁＝5～13min；C_A0＝0.1～10％；C_A1＝13～18％；