[发明专利]一种生产猪源脂联素的方法

说明书

本发明提供了一种生产猪源脂联素的方法，通过人工合成可分泌表达sumo蛋白酶的操纵子、可分泌表达酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素融合蛋白的操纵子，进而克隆得到了猪源脂联素母体基因可在枯草芽孢杆菌表达的载体pZLS‑128，并将其电转化进入枯草芽孢杆菌WB700菌株的感受态细胞中得到重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株，重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株在摇瓶经诱导发酵后可得到猪源脂联素蛋白。本发明具有表达系统简单、可用于大规模生产且生产成本低等优点，为猪源脂联素的商业应用提供了必要的技术支持。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体讲提供了一种生产猪源脂联素的方法。

背景技术

脂肪组织(adiposetissue)主要由大量聚集成团的脂肪细胞构成，脂联素(Adiponectin/ADPN)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性蛋白质。脂联素是一种胰岛素增敏激素(AnInsulin-sensitizingHormone)，能改善小鼠的胰岛素抗性(Insulinresistance)和动脉硬化症；对人体的研究发现，脂联素水平能预示II型糖尿病和冠心病的发展，并在临床试验表现出抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力。

在脂肪细胞分泌的具有生物活性的一类蛋白质因子中，脂联素是脂肪组织基因表达最丰富的蛋白质产物之一，大量存在于血液循环中。在人体内以3-30ug/ml的浓度出现在循环血浆中。脂联素又被称作Acrp30、apM1、AdipoQ、GBP28。最初,脂联素是在人体皮下脂肪组织、血浆和鼠科动物的脂肪细胞中被发现。人体内的脂联素由244个氨基酸组成，分子量为30KD,由氨基末端的分泌信号序列(aa 1-18)，一段特异序列(aa19-41)，一组由22个氨基酸组成的胶原重复序列(aa 42-107)，一段球状序列(aa108-244)组成。其中球状区是脂联素生物活性的关键部位，和TNF-α的结构相似，脂联素与胶原Ⅷ、X和补体C1q高度同源。脂联素的单聚体和三聚体是其生物活性形式或受体亲和配基可以特异性结合骨骼肌或肝脏细胞膜上的G蛋白藕联受体一型或二型脂联素受体，进而调节脂肪酸氧化和糖代谢。

目前关于用基因工程的方法来表达生产脂联素的报道还比较少。枯草芽孢杆菌具有良好的分泌特性，其发酵工艺和产物回收技术也比较成熟，用作外源蛋白的分泌型宿主菌，具有很大潜力。相关研究表明，多种外源蛋白都能在枯草芽孢杆菌中分泌表达，有些还获得了较高的产率。枯草芽孢杆菌WB700菌株是缺失7种胞外蛋白酶的枯草芽孢杆菌突变株，其保外残余的蛋白酶活性只相当于野生菌株的0.1％，是一种表达外源蛋白的理想宿主菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产猪源脂联素方法，以克服当前脂联素在产业化应用中产量不足的问题。目前还没有用枯草芽孢杆菌WB700表达系统生物合成猪源脂联素的报道。枯草芽孢杆菌是一种原核单细胞微生物，具有培养条件易于控制、增殖速度迅速、表达量高和表达产物易于分离纯化等特点。

本发明所提供的生产猪源脂联素的方法包括以下步骤：

1.可分泌表达sumo蛋白酶的操纵子、可分泌表达酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素融合蛋白的操纵子的合成：

a)人工合成含枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导的Pglv启动子、编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽sacB和编码sumo蛋白酶的表达操纵子基因的融合DNA片段SEQ ID No.1(可以是由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成)，其核苷酸序列为：