[发明专利]一种重离子辐照制备染色体缺失细胞系的方法

说明书

技术领域

一种敲除染色体的方法，属于生物技术领域。可以广泛应用于生命科学的基础研究；获得的染色体缺失材料可在农林、食品和环境等领域具有广泛的应用前景。

背景技术

染色体的主要功能是真核生物的遗传载体。但不同染色体具有不同的核苷酸序列，它在细胞、组织、器官等发育、分化以及生物进化中等也会存在显著差异，利用染色体缺失的生物材料，可以更好地研究它们的各自作用；获得的染色体缺失材料也具有广泛的应用前景。

发明内容

将胞嘧啶脱氨酶基因(CD)插入到细胞的特定染色体上，通过单倍体培养和抗生素等试剂的正向选择获得转CD的单倍体。

振荡培养含CD的单倍体制备细胞悬浮系；经重离子辐照细胞系后，接着在含0.0001-10％的5-氟胞嘧啶培养基中振荡培养含CD的悬浮细胞，进行负向选择，培养时间为0.1-100小时。

在覆盖于旺盛愈伤组织的滤纸上接种经过负向选择且已稀释的悬浮细胞，进行10-600小时的看护培养，然后挑选出单细胞团，经鉴定后获得CD插入染色体的缺失细胞。

具体实施方式

1.获得转胞嘧啶脱氨酶基因(CD)甘草基因

1)CD基因的植物表达载体构建

将来自大肠杆菌的CD基因插入到pCOMBIA1304的GFP基因的上游；电导入农杆菌LB4404；挑单菌斑培养、鉴定。

2)农杆菌介导转CD基因

挑经过鉴定的单菌斑，振荡培养20小时；然后，用新鲜培养基将其稀释到OD₆₂₀为0.6-0.9的悬浮液；挑选饱满甘草种子依次经过70％酒精、无菌水、10％次氯酸钠和无菌水消毒清洗后接种在MS固体培养基上；12/12小时光照培养一周，获得无菌苗；剪取幼叶、茎尖等外植体接种在含1mg/L2，4-D的固体MS培养基上诱导愈伤组织发生，2-4天后与培养稀释后的农杆菌温育1-50分钟；取出外植体用无菌水反复清洗后再接种到含50mg/L潮霉素的愈伤组织诱导培养基中；培养7-20天。获得的愈伤组织一部分用于再生芽分化、根诱导形成再生植株；一部分进行继代培养获得松散型愈伤组织，以制备悬浮培养细胞系。

3)转CD基因的植株鉴定

A.GUS瞬间表达鉴定

取出部分愈伤组织、幼芽和根尖进行GUS化学染色鉴定；出现蓝色的阳性材料进行记录，其对应的剩余材料进入下面的实验。

B.CD基因的PCR鉴定

取部分GUS鉴定阳性的材料，按CTAB法提取基因组DNA；利用CD特异性引物进行PCR；PCR阳性的剩余材料进入下一轮试验。

C.CD基因插入1号染色体的植株选择

取PCR阳性植株的根尖制作有丝分裂的细胞装片；在显微镜下寻找含分裂中期细胞的装片；在荧光显微镜下，寻找1号染色体含绿色荧光的装片；验证并确定1号染色体插入GFP和CD的生物材料。

2.通过单倍体培养和抗生素等试剂的正向选择获得转CD的单倍体。

1)花药培养单倍体细胞团及其鉴定

取1号染色体插入CD基因的生物材料栽培；开花后取花粉培养分别在含5-氟胞嘧啶和不含5-氟胞嘧啶的培养基上培养；获得的愈伤组织分别用于下面两个实验。

2)花药培养单倍体植株及其鉴定

愈伤组织加入含激素的诱导幼芽的培养基中诱导再生植株

3.振荡培养含CD的单倍体制备细胞悬浮系

1)制备愈伤组织

2)制备悬浮培养细胞系

4.重离子辐照、负向选择培养，获得缺失含CD基因染色体的悬浮细胞

经80MeV/u碳离子辐照细胞系后，在含0.0001-10％的5-氟胞嘧啶培养基中振荡培养含CD的悬浮细胞，进行负向选择，培养时间为0.1-100小时。

5.看护培养选择单细胞团

1)稀释悬浮细胞系

2)制备生长旺盛的愈伤组织

3)看护培养悬浮细胞

在覆盖于旺盛愈伤组织的滤纸上接种经过负向选择且已稀释的悬浮细胞，进行10-600小时的看护培养

6.然后挑选出单细胞团，经鉴定后获得CD插入染色体的缺失细胞。

1)GUS化学鉴定

2)PCR鉴定

3)细胞学鉴定