[发明专利]水样中甲型肝炎病毒和诺如病毒检测质控试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种水样中甲型肝炎病毒和诺如病毒检测质控试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括HAV2×RT-PCRmix、NVGⅠ+GⅡ分型2×RT-PCRmix、大肠杆菌噬菌体MS22×RT-PCRmix、无RNase水、HAV阳性对照、NVGⅠ+GⅡ阳性对照、大肠杆菌噬菌体MS2（2.5×10¹⁰pfu/mL）各一管。

2.根据权利要求1所述的水样中甲型肝炎病毒和诺如病毒检测质控试剂盒，其特征在于，HAV2×RT-PCRmix、NVGⅠ+GⅡ分型2×RT-PCRmix、大肠杆菌噬菌体MS22×RT-PCRmix中涉及的检测引物和探针如下：

（1）甲型肝炎病毒检测引物和探针：

正向引物HAV-F：5’-TCACCGCCGTTYGCCTAG-3’

反向引物HAV-R：5’-GGGGAGAGCCCTGGAAGAAAG-3’

探针HAV-P：5’-FAM-CCTGAACYYGCAGGAATYAA-MGB-BHQ-3’

（2）

诺如病毒检测引物和探针

诺如病毒GⅠ：

正向引物NVG1-F：5’-CGYTGGATGCGNTTYCAT-3’

反向引物NVG1-R：5’-CCTTAGACGCCATCATCATTYAC-3’

探针NVG1-P：5’-Cy5-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-BHQ-3’

（3）

诺如病毒检测引物和探针

诺如病毒GⅡ：

正向引物NVG2-F：5’-ATGTTCYGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’

反向引物NVG2-R：5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’

探针NVG2-P：5’-FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-BHQ-3’

（4）

大肠杆菌噬菌体MS2检测引物和探针

MS2-TM3-F：5'-GGCTGCTCGCGGATACCC-3

MS2-TM3-R：5'-TGAGGGAATGTGGGAACCG-3

MS2-TM2JOE：5'-JOE-ACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGT-NFQ-3'。

3.利用上述任一项权利要求所述的试剂盒检测水样中甲型肝炎病毒和诺如病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①浓缩病毒

在待检水体中加入100μL过程控制病毒大肠杆菌噬菌体MS2，调节待检水体pH值至7.0，在无菌条件下，过滤全部样品通过直径47mm、孔径0.45μm的正电荷滤膜；转移滤膜至50mL无菌A离心管中，加入4mLTGBE缓冲液；另外10mLTGBE缓冲液加入水样瓶子中，离心管和瓶子500oscillations/min振荡20±5min；收集试管和瓶子里的洗出液至B离心管中；用另外2mLTGBE缓冲液冲洗放滤膜的离心管内壁，轻轻摇晃和颠倒振荡，加入到A离心管里；

用0.1mol/L的HCl调整到pH7.0±0.5，并转移至离心过滤浓缩器；4000×g离心15min，转移浓缩液至干净的1.5mL离心管中；

用PBS调整体积至500μL，以备提取RNA；

②病毒RNA提取

③大肠杆菌噬菌体MS2标准曲线的建立

取制备好的大肠杆菌噬菌体MS2质控样品，稀释至2.5×10¹⁰pfu/mL，取100μL进行提取病毒RNA，最终稀释于100μL无RNA酶H₂O中；取20μL稀释于180μL无RNA酶H₂O，梯度稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍，则病毒浓度分别代表2.5×10⁹、2.5×10⁸、2.5×10⁷、2.5×10⁶、2.5×10⁵、2.5×10⁴pfu/mL，分别进行荧光定量RT-PCR反应，应用Ct值和噬菌体浓度建立回归标准曲线；

④甲型肝炎病毒、诺如病毒、大肠杆菌噬菌体MS2检测

将步骤②提取的RNA分别取5μL，按照甲型肝炎病毒、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型、大肠杆菌噬菌体MS2三种目标分别检测，每个检测目标反应体系包括：2×RT-PCRmix12.5μL、样品5μL、水补齐至25μL，每个样品做原倍提取液和10×稀释提取液，同时设置阳性对照和阴性对照；

⑤病毒RNA回收率确定

根据MS2荧光定量RT-PCR反应获得的Ct值和标准曲线回归方程，计算出MS2浓度，除以加样时的病毒浓度，乘以100%即为回收率，即：回收率（%）=(回收后病毒浓度/加注病毒浓度)×100；

⑥结果判定原则

检测结果判定必须在阳性对照和阴性对照成立的情况下做如下判定：

根据MS2的回收效率判定结果的有效性；若病毒RNA回收率大于或等于1%测试有效，根据检测情况判定甲型肝炎病毒和诺如病毒GⅠ型和GⅡ型检测结果；若病毒RNA回收率小于1%，则需要重新进行检测。