[发明专利]一种仿生双链磷脂膜整体柱及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于色谱分离技术领域，具体涉及一种仿生双链磷脂膜整体柱及其制备方法与应用。

背景技术

磷脂膜色谱又称固定化人工膜色谱(Immobilized Artificial Membrane,IAM)，是新药研究中广泛使用的一种模拟生物膜色谱法，由于固定相结构跟细胞膜磷脂层类似，具有很好的仿生特性，已成功应用于预测药物的小肠吸收、血脑屏障通透性、透皮吸收、体内分布、药效活性等方面[Valkó KL,Nunhuck SB,Hill AP.Estimating unbound volume of distribution and tissue binding by in vitro HPLC-based human serum albumin and immobilised artificial membrane-binding measurements.J Pharm Sci.2011,100(3):849-862；Liu YY,Li LL,Dai RJ,Qu F,Geng LN,Li XM,Deng YL.Assessment of the Enzymatic Activity and Inhibition using HPFA with a Microreactor,Trypsin,Absorbed on Immobilized Artificial Membrane.J Chromatogr Sci.2010,48(2):150-155]。目前，商业化磷脂膜色谱柱只有磷脂酰胆碱(Phosphatidyl cholines，PC)的填充柱(Regis Chem Co,Morton Grove，IL，USA)，主要制备策略是通过双链的酯键、单链的醚键或者删除甘油骨架的单链将磷脂酰胆碱极性官能团键合到硅胶表面，可以很好地用于蛋白质分离和预测药物的膜渗透性等。但目前的IAM填充柱存在如色谱柱填充制备复杂、磷脂类型单一、细胞膜仿生性不强、pH适应范围窄等不足，严重限制了磷脂膜色谱柱在药物研发中的应用。

有机聚合物整体色谱柱(monolithic column)是由单体、交联剂、致孔剂和引发剂等组成的混合物通过原位聚合得到的连续均一的棒状聚合物，它具有制备过程简单、渗透性好、传质速度快、生物兼容性好、耐酸碱性好、单体种类多等优点，可实现快速、高效、高通量的分离，近年来已引起人们的热切关注[Smith NW,Jiang Z.Developments in the use and fabrication of organic monolithic phases for use with high-performance liquid chromatography and capillary electrochromatography.J Chromatogr A 2008,1184(1-2):416-440；Jiang Z,Smith NW,Liu Z.Preparation and application of hydrophilic monolithic columns.J Chromatogr A 2011,1218(17):2350-2361.]。针对不同的分析客体和目的，设计合成新型的单体，并制备相关的特殊结构的整体柱，一直是整体色谱柱研究的热点。本课题组[Jiang Z,Reilly J,Everatt B,Smith NW.Novel zwitterionic polyphosphorylcholine monolithic column for hydrophilic interaction chromatography.J Chromatogr A.2009,1216(12):2439-48.]用2-甲基丙烯酰羟乙基磷酰胆碱(MPC)为单体，成功制备了含2个碳链磷酸胆碱官能团的毛细管整体柱，具有良好通透性、机械强度和孔径分布，但与细胞膜磷脂层的18个碳链长度连接磷酸胆碱官能团的结构相差较大。在此基础之上，本课题组[Zhao XL,Chen WJ,Liu ZH,Guo JL,Zhou ZY,Crommen J,Moaddel R,Jiang ZJ.A novel mixed phospholipid functionalized monolithic column forearly screening of drug induced phospholipidosis risk.J Chromatogr A.2014,1367,99-108；Zhao XL,Chen WJ,Zhou ZY,Wang QQ,Liu ZH,Moaddel R,Jiang ZJ.Preparation of a biomimetic polyphosphorylcholine monolithiccolumn for immobilized artificial membrane chromatography.J Chromatogr A.2015,1407,176-183.]设计并成功制备了含磷脂酰胆碱官能团的单链PC整体柱和由单链PC及磷脂酰丝氨酸(PS)组成的混合型磷脂膜整体柱均具有良好通透性和机械强度等特点，并且发现它们能分别应用于药物膜作用预测和药物磷脂沉积风险预警。但是，细胞膜的磷脂组成主要由双链磷脂构成，尽管单链磷脂膜固定相具有一定的仿生膜能力，但可能不能真实地模仿生物膜磷脂环境。这一猜想得到了Barbato等人的证实[Barbato F,Di Martino G,Grumetto L,La Rotonda MI.Prediction of drug-membrane interactions by IAM–HPLC:effects of different phospholipid stationary phases on the partition of bases.Eur J Pharm Sci.2004,22,261-269.]，他们认为：相对于单链磷脂膜仿生系统，双链磷脂膜固定相往往表现出更好地细胞膜环境模拟能力。此外，双链磷脂膜材料还可以被应用在色谱柱上构建双层磷脂膜分子骨架，进而作为载体固定膜蛋白[Marra KG,M.Winger T,R.Hanson S,L.Chaikof E.Cytomimetic biomaterials.1.In-situ polymerization of phospholipids on a alkylated surface.Macromolecules 1997,30,6483-6488.Moaddel R,W Wainer I.The preparation and development of cellular membrane affinity chromatography columns.Nature protocol 2009,4,197-205.]，从而在色谱固定相上真实地模拟细胞膜组成，最终获取可靠的药物膜作用信息。但迄今为止，双链PC整体柱的研究是非常少的，这可能归因于得到能用于制备双链PC整体柱的功能性单体是非常困难的。近期Wiedmer等[Moravcová D,Carrasco-Correa EJ,Planeta J,M,K.Wiedmer S.Phosphatidylcholine covalently linked to a methacrylate-basedmonolith as a biomimetic stationary phase for capillary liquidchromatography.J Chromatogr A.2015,1402:27-35.]通过整体柱柱后修饰的方法，将大豆磷脂酰胆碱键合到基质柱上，成功制备了一种新型的含双链PC的磷脂膜整体柱并将其用于药物膜作用预测。但该整体柱可能仍然不能真实地模拟生物膜，因其在双链PC外引入了一条长烷基疏水链，这将不仅影响整个仿生系统的疏水环境，而且可能会不利于PC官能团在整体柱表面的有序排列，从而不能有效模拟细胞膜磷脂环境，最终导致药物膜作用预测能力下降。鉴此，制备与细胞膜磷脂双分子层高度接近的有机聚合物，开发出制备简单、重现性和稳定性好、选择性强、预测准确性高的新型双链磷脂膜整体色谱柱和以此为母体基质制备成的细胞膜亲和整体柱，可为新药研发中预测与药物膜相互作用、细胞膜渗透性、药物磷脂沉积安全性等有关的药理作用提供有效的技术支撑。