[发明专利]一种体外完成细胞减数分裂的方法

说明书

本发明提供了一种体外完成细胞减数分裂的方法，包括以下步骤：1)将原始生殖细胞或原始生殖细胞样细胞(PGCLCs)与睾丸细胞以1：1的比例混合后在含有减数分裂启动因子的细胞培养基中共培养至形成细胞集落并检测到减数分裂启动基因表达，得到启动减数分裂的细胞；2)将步骤1)得到的启动减数分裂的细胞转移至含减数分裂维持因子的细胞培养基培养，至检测到单倍体精子细胞特异基因表达，经分选获得单倍体。给干细胞分化技术治疗男性不育应用上临床提供了技术基础。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种在体外完成减数分裂获得功能配子的方法。

背景技术

不孕不育困扰着越来越多的家庭，而男性因素导致的不育约占到不孕不育总数的一半。而对于那些无精子症导致的男性不育患者，由于没有成熟的雄性配子而不能接受辅助生殖治疗，因此不能够得到真正意义上的子代。对于这些患者，科学家们始终在尝试利用干细胞分化技术，帮助他们重新分化出多能性干细胞来源的功能性雄性配子。

现有技术中已经可以做到将小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)在体外分化成原始生殖细胞样细胞(Primordial germ cell-like cells,PGCLCs)，再将PGCLC移植回到不育症模型小鼠的睾丸曲细精管内完成生殖细胞的减数分裂过程，从而得到有功能的精子细胞。人类生殖细胞分化研究已经可以做到将ESC分化到PGCLC，但对于分化得到的PGCLC是否具有功能并没有进一步评估。原因在于，目前除了移植回睾丸的曲细精管以外，没有可以使生殖细胞完成减数分裂的方式。而对于人类而言，将多能性干细胞分化来的功能细胞移植回体内仍存在着包括致瘤性在内的很多风险。如果要将雄性配子分化技术运用上临床，还是需要寻求一种可以将ESC直接在体外分化成精子细胞的方法。

发明内容

本发明首先利用生殖细胞体外分化技术，模拟体内胚胎发育过程，将ESC先分化成外胚层类似细胞(Epiblast like cells,EpiLCs)，再使EpiLC在骨形态发生蛋白4(Bonemorphogenetic protein 4，BMP4)等因子的诱导下，转变为原始生殖细胞样细胞(PGCLC)。之后，利用唯支持细胞综合征的新生小鼠的睾丸细胞与分化得到的PGCLC混合培养，同时给予减 数分裂信号-视黄酸(Retinoic acid,RA)、睾酮(T)、促性腺激素(FSH)及垂体提取物的刺激，完成减数分裂，并产生单倍体。最后，利用流式细胞分选技术分选出单倍体的精子细胞可用于进行圆形精子细胞卵浆注射(round spermatid injection,ROSI)，得到健康出生的子代小鼠。

本发明提供了一种体外完成细胞减数分裂的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将原始生殖细胞或原始生殖细胞样细胞(PGCLC)与睾丸细胞以1：1的数量比例混合后在含有减数分裂启动因子的细胞培养基中共培养至形成细胞集落并且检测到减数分裂启动基因表达，得到启动减数分裂的细胞；

2)将步骤1)所述的启动减数分裂的细胞转移至含有减数分裂维持因子的细胞培养基，以维持细胞的减数分裂，至检测到单倍体精子细胞的特异基因表达，经分选获得单倍体；优选地，所述分选是通过流式细胞仪实现的；

其中，所述减数分裂启动因子包括视黄酸(Retinoic acid,RA)、骨形态发生蛋白2(BMP 2),骨形态发生蛋白4(BMP 4),骨形态发生蛋白7(BMP 7)和转化生长因子β家族激活素A(Activin A)；优选地，所述减数分裂启动因子的剂量分别为视黄酸10^-6M，骨形态发生蛋白2(BMP 2)的浓度为20ng/ml、骨形态发生蛋白4(BMP 4)的浓度为20ng/ml、骨形态发生蛋白7(BMP 7)的浓度为20ng/ml；转化生长因子β家族激活素A(Activin A)的浓度为100ng/ml。