[发明专利]测序文库及其制备和应用

说明书

本发明公开一种测序文库，所述文库包括一种核苷酸序列，该序列包括一段连接序列和两条目标序列，所述连接序列两端分别连接所述目标序列，两条所述目标序列为同向重复序列。本发明还公开了该测序文库的制备和应用。该测序文库解决了现有技术中DNA测序准确率不能满足实际需求的问题。

技术领域

本发明涉及一种测序文库及其制备和应用。

背景技术

第二代测序技术的发展，推动了生物学以及生物医学研究的革命性发展。但是由于高通量测序本身的特点，在测得的序列中存在约1％的碱基错误。虽然在一些应用中1％的错误率是可以忍受的，但是在很多情况下，这1％的错误却掩盖了很多真实的信息，而成为很多研究的障碍。比如：在微生物诱变过程中，如何监测某种诱变剂在不同诱变浓度下造成突变频率分布模式，从而有效地优化诱变体系、提高诱变效率；如何在一个大的诱变群体中筛选某株带有目标突变的目标菌；检测一个正常个体的某一组织或器官是否存在潜在的致癌突变位点、检测癌症细胞群体中DNA组成的异质性以及隐藏的小克隆群体、利用每个细胞中的DNA突变作为标记追溯该细胞的起源及分裂模式、准确获取一个高度杂合的癌症群体中的基因型、计算癌症细胞或体细胞分裂时突变产生的速率、寻找生物医学治疗中一些小群体(如癌症干细胞等)中存在的致病突变，筛查或检测外周血游离DNA中的致病、致癌突变以及及疾病的早期预测等。如何利用现有的二代测序技术准确的测定DNA的序列，就成了一个非常关键的问题。

截止目前，有一些方法尝试从生物、化学等方面对二代测序的错误进行改进，如无扩增的建库方法，有效的避免了文库准备过程中因聚合酶链式反应扩增产生的错误。通过对样品DNA和参考DNA分别加相应的标签，从而有效过滤链特异性的错误。有一些方法则从数据分析角度降低二代测序的错误率。另外，还有一些方法通过DNA随机打断时产生的断点信息或者在聚合酶链式反应扩增之前对DNA模板加入相应的标签来矫正由于聚合酶链式反应扩增产生的错误。通过加入标签，就可以确定哪些DNA分子来自于同一条分子，从而达到矫正的作用。

这些方法从一定程度上提高了二代测序的准确性，但是由于各自方法的缺陷性，比如在金迪及其同事的文章(Kinde I,Wu J,Papadopoulos N,Kinzler KW,Vogelstein B(2011)Detection and quantification of rare mutations with massively parallelsequencing.Proc Natl Acad Sci USA 108:9530–9535)中，加入标签的方法是通过将标签加在特定引物的末端，通过聚合酶链式反应的方式将标签加入到DNA分子中，当加入标签时的聚合酶链式反应发生错误时，这种错误在后面的实验中就很难去除，从而限制了其对极低频位点的检测。对DNA进行外源加标签方法的一个非常大的局限是这种方法只能针对于小的基因组或者少数的目的基因，无法实现对整个基因组的全面检测。因为标签法需要测到相同和互补的标签才能起到DNA正负链相互校正的目的，这样就需要极高的测序深度，因此对于大的基因组是很难实现的。

鉴于此，阮珏、王开乐等人开发了一种DNA文库构建方法(201310651462.5号专利申请文件)，该方法通过将DNA分子单链环化，进行滚环扩增，将同一分子复制的产物串联在一起，通过前后两个拷贝的单独测序信息，校正去除文库构建及测序过程中产生的错误，有效降低了测序的错误率，增加了数据的利用率。但是由于滚环扩增产生的偏好性，极大限制了其应用。在后续实验中，王开乐，阮珏等针对滚环扩增的偏好性问题，做了进一步改进(201410448968.0号专利申请文件)，在一定程度上降低了滚环扩增的偏好性。但是依然没有较好的解决滚环扩增所引入的巨大偏好性。滚环扩增具有极大的序列偏好性，以至于个别环状DNA扩增倍数极大，而绝大多数环扩增的倍数很低，在后续的测序过程中，很难实现对整个基因组的全面的有效的精准检测。

综上所述，开发一种能够快速、有效、高精确地测定DNA序列的测序文库是十分必要的。

发明内容