[发明专利]一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR引物体系及检测方法

说明书

一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR引物体系及检测方法，包括如下步骤：以样品总DNA为模板，利用所述引物对I、引物对II和引物对III组成的微滴PCR引物体系进行微滴PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。其中，所述样品总DNA模板为猪、羊、牛物种肉产品中的一种以上。本发明公开了一种快速、准确、灵敏的微滴PCR同步检测3种动物源性成分的方法，能有效缩短实验时间，大大提高效率，且节省成本，从而有效鉴定猪羊牛制品的真伪及掺假情况。此外，本发明设计的微滴PCR引物体系配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR引物体系及检测方法。

背景技术

我国是世界动物源性食品生产和消费大国。2013年国民经济和社会发展统计公报显示，全年猪牛羊禽肉产量8373万吨，比上年增长1.8％，其中猪肉产量5493万吨。我国作为猪肉生产消费大国，猪肉产品却难以进入国际市场。为确保食品成分的真实性，质检“十二五”规划纲要明确指出，需重点加强开展食品掺假鉴别技术研究。其中猪肉的掺假不仅侵害消费者利益，还可能因某些宗教食品中含有非清真成分引起纠纷，不利于维护社会安定。如果问题产品出口到国外更会损害我国食品企业的整体形象。

目前，为了确定肉及肉制品的真实性，已经研发出了包括基于核酸的分子生物学技术，如PCR、实时定量PCR和分子指纹技术，基于蛋白质分子结构的免疫分析技术，红外光谱技术以及质谱技术等动物源性成分鉴别方法。基于动物种属间遗传信息的差异从核酸分子水平上动物进行肉种鉴定以及对动物源性食品进行检验研究，是目前动物源性成分研究的最有效手段。作为鉴别的检测靶点而被广泛使用。目前，以检测DNA为基础的方法主要有：核酸探针杂交、PCR-RFLP分析、DNA指纹分析、PCR特异扩增。其中，PCR特异扩增法最为简便、准确、灵敏，在实际检测中应用最为广泛，其它分析法由于操作难度大，在实际检测中较少应用。

针对动物源性食品中存在的问题，我国近些年也加强了肉类安全性的认识，制定了《传染病防治法》、《动物防疫法》、《食品卫生法》、《进出口商品检验法》等相关的法律法规。2007年以来，国家标准化管理委员会颁布了关于动物源饲料中动物成分(牛、绵羊、山羊、猪、兔、鹿、马、驴、狗、骆驼)定性检测国家标准。这些检测标准目前主要集中在利用传统的常规PCR技术，而且只能对动物源性肉及肉制品进行单一种的定性检测。在肉类食品样本实际检测过程中，对于成分不明确或混合的加工制品，需要通过多次检测试验才能确定，其周期长、工作量大、成本高。在未来的动物源性肉及肉制品的检测中，这类检测技术已经越来越不能胜任一次处理几种甚至十几种动物源制品的特殊需要，尤其是大数量的加工产品进入商品化生产时，需要更有效的、快速的检测方法。

在肉类食品样本实际检测过程中，对于成分不明确或混合加工制品，需要通过多次检测或多重检测试验才能确定。多重PCR技术能够实现同时扩增多个目标基因，微滴PCR就是PCR技术和乳化技术相结合的最先进的PCR技术，是将PCR反应体系分隔成10⁹个独立的微滴，每个微滴含有一个或两个模板和引物，同时平行地进行扩增，消除了多重PCR的固有缺陷，提高了目标扩增的通量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR引物体系及检测方法，快速且高特异性检测猪羊牛肉制品的真伪及其是否有掺假，大大提高效率，节约时间，而且节省检测成本，特别适用于猪羊牛制品的快速防伪鉴定。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR引物体系，包括如下猪特异性引物对I、羊特异性引物对II、牛特异性引物对III：

(1)对猪12SrRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的猪特异性引物对I：

正向引物：5’-CTACATAAGATATCCACCACA-3’；