[发明专利]检测循环肿瘤细胞的电化学免疫传感器的制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞检测技术领域，更具体的说是一种通过半导体催化产生还原电流，合金增强还原电流，从而检测循环肿瘤细胞个数，属于超灵敏的电化学细胞免疫传感器的制备技术。

背景技术

近年来，免疫分析是临床检验中一项重要的肿瘤疾病的诊治手段。一直以来，恶性肿瘤也就是癌症是人类健康和生命安全的一个严重威胁。癌症细胞，是指一些拥有分裂潜能的细胞在致癌因素的作用下发生了恶性转化和克隆性增生而产生的一种新生物。并且癌细胞除了自身的生长失控外，还会侵入周遭正常组织甚至可以经由体内的循环系统或者淋巴系统转移到身体的其他部分，从而引起身体病变甚至死亡。所以，癌症早期的诊断和及早的治疗具有重要的意义。但是癌症早期的癌细胞含量较低很难被发现，低含量的癌症细胞的测定成为了分析人员的重要追求。

免疫分析主要是基于用抗体（或抗原）作为选择性化学试剂以分析测定抗原(或抗体)及半抗原。它的提出及发展是生物分析化学最伟大的成就之一估计全世界每年要进行数亿次的免疫分析。免疫分析中发展快、应用广的首推放射免疫分析法（RIA），RIA主要优点是，仪器自动化，操作简便，灵敏度高，样品制备简单；同时，由于临床样品中不存在放射活性物质，因而干扰少。然而，RIA需要进行放射性操作，仪器价格又贵，这便激发了科学家们努力探索非放射性标记的免疫分析方法，迅速发展起来了酶联免疫分析（ELISA）、发光免疫分析（LIA）、电化学免疫分析（ECIA）等方法。但是这些免疫分析方法一般耗时较长并且拥有繁琐的加样、温育、洗涤等操作过程，而且操作人员和免疫物质的接触较多，可能对操作的人员的身体健康造成危害。而且有些测定速度快、灵敏度高、检测性低的检测手段需要仪器昂贵，不能在发展中国家普及。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一种灵敏度高、检测速度快、试剂用量少，检测循环肿瘤细胞的电化学免疫传感器。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：一种检测循环肿瘤细胞的电化学传感器的制备及应用方法，其包括以下步骤：

（1）按照现有方法制备出五氧化二钒纳米线，金银核壳纳米粒子；

（2）将五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子结合修饰适配体；

（3）将金纳米粒子修饰于电极表面，后连接硫醇化的适配体，特异性结合循环肿瘤细胞，再连接五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体；

（4）将制作好的电化学传感器结合电化学工作站对循环肿瘤细胞进行检测。

本发明所述五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子结合修饰适配体及电化学传感器的制备及应用包括以下步骤：

（1）五氧化二钒纳米线的制备：其特征是将水溶性的硫酸氧钒与氧化剂溴酸钾在室温下混合，磁搅拌反应30 min，后通过硝酸降低酸度，将混合物水溶液在高压釜中以180 ℃反应24 h，取出高压釜冷却至室温，二次水多次冲洗得深黄色沉淀，将沉淀在80 ℃烘箱中烘干备用；

（2）金纳米粒子储备液的制备：其特征是将1.25 mL 10 mM的氯金酸加入42.65 mL二次水，置于100 mL容量的三口圆底烧瓶中，在磁搅拌的情况下加热30 min，后加入2.5 mL 1 %的柠檬酸钠，10 min内溶液先由黄色变为蓝灰色，最后变为软粉色，溶液经过离心和二次水洗，后再分散于二次水中，得到金纳米粒子储备液；

（3）金银核壳纳米粒子的制备：其特征是将7 mL（2）制备的金纳米粒子储备液与0.65 mL 0.1 %聚乙烯吡咯烷酮混合，磁搅拌20 min，后加入1.5 mL 0.05 mM的β-环糊精和1.5 mL 0.05 mM的半胱氨酸，磁搅拌几分钟混匀。加入氢氧化钠溶液孵化10 min调整pH至10，将混合溶液85 °C水浴。后连续磁搅拌30 min，逐滴加入3 mL 0.1 mM的硝酸银溶液，滴加过程中，溶液逐渐由粉色变为亮黄色，得到金银核壳纳米粒子；

（4）五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子的制备：其特征是将（1）制备的五氧化二钒纳米线取10 mg溶解于1 mL二次水中，加入1 %的氯化己二烯二甲基胺溶液，超声30 min，离心水洗4次，后加入（3）制备的金银核壳纳米粒子0.5 mL，磁搅拌1 h，沉淀离心水洗多次至颜色不变，最后获得五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子；