[发明专利]一种昆虫细胞表达抗菌肽Cecropin DC1的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种昆虫细胞表达抗菌肽CecropinDC1的方法。

背景技术

抗菌肽是一类具有生物活性的小分子碱性多肽，具有杀菌力强、抗菌谱广、稳定性好及不产生耐药性等优点，更为重要的是抗菌肽对真核细胞几乎没作用，仅作用于原核细胞及发生病变的真核细胞。

现有技术查阅发现中国专利ZL200510032743.8公布了一种抗菌肽DC及其制备方法与应用，根据天然抗菌肽的序列，设计、合成抗菌肽DC基因，选择酵母偏爱的遗传密码子，转化穿梭质粒，转入季也蒙念球菌中表达。但目的基因DC在季也蒙念球菌中的表达量受到限制、质粒转化体不稳定，目的基因容易丢失等缺点。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种昆虫细胞表达抗菌肽CecropinDC1的方法，利用基因工程，构建含有抗菌肽CecropinDC1基因的重组病毒，并利用Sf21细胞作为宿主，表达生产具有生物活性的重组抗菌肽CecropinDC1。

本发明通过以下技术方案来实现：

1、一种昆虫细胞表达抗菌肽CecropinDC1，通过点突变技术，将第38位赖氨酸的密码子AAG改为天冬酰胺的密码子AAC。此处氨基酸密码子的改变对表达产物的杀菌活性明显的提高。

2、所述的昆虫细胞表达CecropinDC1，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

3、一种昆虫细胞表达CecropinDC1的重组核苷酸序列，包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

4、一种昆虫细胞表达抗菌肽CecropinDC1的方法，包括以下步骤：

1）构建包含SEQIDNO：1所示核苷酸序列的重组杆状病毒转移载体。

2）将构建好的重组转移载体与苜蓿银蚊夜蛾多核型多角体病毒AcNPV-DNA共转染Sf21昆虫细胞，按以下方式获得表达抗菌肽Cecropin的重组病毒。

在1.5ml灭菌的Eppendorf管中加入2μg重组转移载体DNA、10μgAcNPV-DNA及0.8ml共转染缓冲液，将该混合物在室温下孵育30min后共转染对数期的Sf21昆虫细胞；然后将共转染后的Sf21细胞先用无血清培养基Sf-900IISFM培养基清洗两次，再用含有10%FBS的完全培养基在27℃下培养4~6d，收集培养基上清作为病毒原液用来筛选重组病毒，重组病毒经过空斑筛选，获得病毒溶液，该病毒溶液命名为含有抗菌肽CecropinDC1基因的重组病毒。

3）重组病毒感染旺盛生长的Sf21细胞，27℃培养4~6d进行感染表达，之后通过离心收集培养液。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

1、抗菌肽CecropinDC1是一个经过修饰改进的基因。将第38位的赖氨酸改为天冬酰胺，这种氨基酸密码子的改变使其具有较高的杀菌效价，特别是对多种病原微生物有较好的抑菌作用，如大肠杆菌、金黄葡萄球菌等。

2、本发明解决了抗菌肽CecropinDC1在季也蒙念球菌表达中质粒转化体不稳定，目的基因容易丢失和在哺乳动物细胞生产成本太高等缺点，获得的Sf21细胞表达重组抗菌肽CecropinDC1具有较高的生物活性，且大部分被分泌到培养基中，有利于蛋白的快速提取纯化。本发明的抗菌肽CecropinDC1可以大量生产，并且为抗菌肽CecropinDC1在医学、食品和化妆品上的应用开辟了广阔的前景。

附图说明

图1是抗菌肽CecropinDC1的PCR扩增产物；

1：目的基因PCR产物，M：Marker。

图2是本发明抗菌肽CecropinDC1抗菌活性定量测定；

1：抗菌肽CecropinDC1发酵液，2：抗菌肽DC发酵液，3：无菌水。

图3是本发明抗菌肽抗菌肽CecropinDC1抗菌活性定性测定；

CK^—：无菌水，CK⁺：Amp，1：抗菌肽DC，2：抗菌肽CecropinDC1。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

抗菌肽CecropinDC1基因的克隆

根据抗菌肽CecropinDC1基因改造和克隆的需要,利用Primerpremier5.0软件设计、合成引物：

P1：5’ATGAAATGGAAGTTGTTCAAAAA3’；