[发明专利]一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用

说明书

本发明公开了一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用，该蛋白具有426个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白理论等电点为9.150，分子量为47.18kD；该蛋白具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所对应的基因序列中开放阅读框（ORF）全长1281bp。实验结果表明：河蟹肝胰腺组织切片的免疫组化结果进一步印证了这一推断。而且，基因序列分析显示Esflol蛋白含有两个可能的cAMP或cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点，提示Esflol存在参与到cAMP/cGMP介导的信号通路的可能性。结果证明Esflol是CHH调控的信号通路中的一环。对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白在和CHH特异结合，提升了熟蟹肝胰腺的营养价值和风味。

本研究受到国家自然科学基金青年基金（31302168）；天津市应用基础与前沿技术研究计划(一般项目)（14JCYBJC30700）；天津师范大学博士基金（52XB1303）的支持。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用。

背景技术

甲壳动物高血糖激素（CHH），是神经多肽激素家族的成员之一。该蛋白仅存在于节肢动物中，在血淋巴葡萄糖水平调节、蜕皮以及应激过程中起着关键作用。虽然细胞膜上的鸟苷酸环化酶（GC）已被公认为Y器官的CHH受体，但在肝胰脏中的受体仍然没有确定。在本研究中，我们通过对河蟹转录组分析，筛选并克隆到了一个在去眼柄后表达量提高了2.8倍的基因—中华绒螯蟹flotilin类似蛋白（Esflol）作为目标分子去研究。通过体外原核表达系统，我们获得了重组flotilin蛋白。利用CHH与重组flotilin蛋白的Pull-down实验以及大分子互作仪检测，我们发现CHH可以和flotilin直接结合。该结果是首次在甲壳动物肝胰腺中发现的CHH结合蛋白，同时表明可以通过体外表达flotilin来调节CHH的浓度。

甲壳动物高血糖素（CHH）属于CHH神经肽家族。这个家族包含了一类结构相关的多肽，包括蜕皮抑制激素（MIH），卵黄/精巢抑制激素（VIH/GIH），大腭器抑制激素（MOIH）以及离子转运多肽（ITP）。所有这些成员都只在节肢动物中发现。

学界广泛认为，CHH是能够调控几种生理活性的多效分子，如血糖水平，脂类代谢，蜕皮与应激反应。第一次对CHH的描述是关于其对糖代谢的调控的。肝脏和肌肉是CHH的主要靶标器官，肝脏在蜕皮过程中的所起到的作用是储存能量，肌肉亦是另一个糖原的储存场所。学者们认为，CHH在对下游分子的调节机理上在肝脏和肌肉这两种器官中是明显不同的。肌肉的糖原只供给其自身，相比之下肝脏所合成与储存的糖原是供给全身的。

在外界环境的胁迫下，机体中糖原的变化和总碳水化合物的变化总是伴随着CHH的分泌量的变化。当剪去斑节对虾和罗氏沼虾的眼柄后，糖原磷酸化酶明显下降而糖原合成酶的明显上升，这预示着去除眼柄能够促进糖原的积累。另外，肝胰腺在含CHH溶液中的浸泡能够使得葡萄糖转化为糖原的比例降低。综合这些得到的证据表明CHH确实是参与肝脏的糖原代谢的，但CHH的受体以及信号传导通路还是不明确。在甲壳动物中，已经明确的证实了当减去眼柄之后，肝脏的细胞内cGMP水平会显著下降，而不是cAMP。也即表明，在甲壳动物中蛋白激酶G替代了蛋白激酶A参与到了CHH介导酶激活系统。但是细胞膜表面直接和CHH作用的分子依然悬而未决。

flotilins被认为是定位在细胞膜表面脂筏（lipid raft）上的连接性蛋白。除此之外，它们能分布在细胞内体，吞噬体，高尔基体甚至细胞核，直到现在，关于flotilins是否只在质膜上存在还没有定论。