[发明专利]一个鉴定双孢蘑菇优质菌株的ISSR标记及应用

说明书

技术领域

本发明属于食用菌DNA标记辅助育种领域，更具体涉及一个鉴定双孢蘑菇优质菌株的ISSR标记及应用。

背景技术

双孢蘑菇是我国的大宗食用菌之一，2014年全国双孢蘑菇总产量达200多万吨，占世界年产量的一半左右，产值超百亿元人民币。据测算，每生产1吨鲜蘑菇，即可转化1吨养殖业废料和2吨种植业废料，解决1个农村劳动力就业，因此经济效益、社会效益和生态效益显著。

双孢蘑菇的栽培起源于法国，至今已有300多年的历史，近几十年来欧美等发达国家的双孢蘑菇生产都采用工厂化生产模式，配套以产量高、周期短的工厂化生产专用品种，产品基本都鲜销。而我国上世纪20年代才从国外引进双孢蘑菇到国内栽培，80年代才形成一定规模的生产。虽然目前已有一定数量的工厂化生产厂家，但数十年来一直以农业生产为主，至今农业生产仍占到总量的80%以上，产品除鲜销外，部分还加工成罐头出口，因此所用的品种也要求以优质为主、兼顾产量的品种，如本单位选育的As2796系列。因此，具有优质性状的双孢蘑菇种质资源及新品种对我国的双孢蘑菇产业至关重要。

在双孢蘑菇育种技术上，国内外目前都以杂交育种为主，国内以本单位的同工酶辅助杂交育种为主导技术，国外仍以出菇筛选为主。上世纪90年代以后国内外多家单位均开展了DNA分子标记辅助育种技术，在亲缘关系分析、杂交亲本选择、同核体鉴定等方面得到一定的应用，但在关键农艺性状如产量、质量、抗病、抗逆等方面的分析却鲜有成功的报道。ISSR(Inter-SimpleSequenceRepeat，简单序列重复区间)是一种基于微卫星序列发展起来的新型DNA分子标记技术。它利用人工设计合成的核苷酸重复序列引物对SSR(SimpleSequenceRepeat，简单序列重复)之间的DNA序列进行半随机PCR扩增，可获得丰富的多态性。我们通过大规模的ISSR引物筛选和大量的菌株验证，找到了一个适用于双孢蘑菇菌株优质性状预测的ISSR标记与方法。该标记与双孢蘑菇优质性状紧密连锁，利用该分子标记能在双孢蘑菇杂交育种中快速地鉴定菌株的优质性状，而不必经过费时费力的出菇试验，这对杂交育种中优质亲本选择与跟踪鉴定、提高育种效率有重要的意义。

发明内容

本发明基于分子标记技术，建立一个鉴定双孢蘑菇优质菌株的ISSR标记及应用。

本发明为一个鉴定双孢蘑菇优质菌株的ISSR标记及应用，是利用ISSR分子标记对双孢蘑菇菌株进行PCR扩增。

利用ISSR引物对双孢蘑菇菌株基因组DNA进行ISSR-PCR，优质类型的菌株能扩增出1600bp和850bp的特异性条带，所述ISSR引物的核苷酸序列为：5’-AGAGAGAGAGAGAGAGC-3’。

所述的ISSR-PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸90s，扩增40个循环；72℃延伸7min，4℃保存。反应体系为：模板DNA30ng，引物30ng，dNTPs0.1mmol/L，MgCl₂2.5mmol/L，TaqDNA聚合酶1U，1×PCR缓冲液，用ddH₂O补总体积至20μL。

所述引物在鉴定双孢蘑菇优质菌株上的应用。

本发明的方法用于特异性地鉴别双孢蘑菇菌株的优质或非优质特性，该方法耗时短，操作简便，特异性强，无需出菇，省时省力。根据特异性扩增产物1900bp和850bp条带的有无来鉴定菌株的优质或非优质性状，具有该2条带的菌株为优质菌株，没有该2条带的菌株为非优质菌株。

附图说明

图1双孢蘑菇24个优质菌株的ISSR图谱，M:LambdaDNA/EcoRI+HindIIIMarkers；1-24：沪8213，8211，闽1号，As376，As1671，As1789，As321，As555，T-8205，A，D，沪101，21，22，175，751，福罐3，福罐10，厦前751，仙游841，沪102-1，黄岩62，浣沙176-4，Ag10。右边箭头指示2条特异条带位置，显示24个优质菌株均扩增出850bp特异条带，有22个扩增出1600bp特异条带。图中箭头指示2个菌株未扩增出1600bp条带。