[发明专利]一种基于一阶贝塞尔光束的STED超分辨显微镜及调节方法

说明书

技术领域

本发明涉及显微镜技术，具体涉及一种基于一阶贝塞尔光束的受激辐射损耗超分辨显微镜及其调节方法。

背景技术

超分辨显微成像技术在生物成像、材料表征以及激光精细加工等领域产生了重大的影响。其中受激辐射损耗STED显微镜是一种在共聚焦点扫描式显微镜的基础上，通过直接调节信号产生区域面积从而实现超分辨成像或者激发的显微技术，相较于其他类型的超分辨显微技术，其原理较为简单，且成像速度较快，可以进行活体实时超分辨成像，在生物医学领域有着巨大的应用，并且在纳米材料研究，激光加工以及光存储领域提供了一种新的可行的方法。

受激辐射损耗显微技术需要两束光进行照明。其中一束未经调制的高斯光(激发光)经过物镜聚焦后产生一个近似于爱里斑的激发区域，焦点处的荧光物质发出荧光；另一束不同波长的高斯光通过0-2Pi螺旋形相位板的调制(损耗光)，在物镜焦平面位置形成一个中空的面包圈状的光斑，其中心光强接近于零，这样使处在圆环上光强较强区域内的激发态的荧光分子以受激辐射的方式跃迁回基态，不再发出荧光，这样只有面包圈中心附近损耗光光强较弱的区域才能产生荧光，减小了荧光发光区域的面积从而突破衍射极限，提高分辨率。但是，这束损耗光对于相位分布十分敏感，对于高像差的样品，在对其内部进行成像时，由于像差和散射导致损耗光聚焦光斑的形貌产生畸变，从而使分辨率急剧下降。

近年来，为了提高STED显微镜的成像深度，已经有人通过调节物镜校正环，在80-100微米的深度达到稳定的分辨率，但是这些方法通常操作较为复杂且对于高散射样品并不一定适用。还有人使用自适应光学系统对样品带来的像差进行补偿，但系统比较复杂且昂贵。

发明内容

针对以上现有技术中STED显微镜在深层成像时遇到的问题，本发明提出了一种利用贝塞尔光束的抗散射和自愈特性，将损耗光变为一阶贝塞尔光束，从而具有一定的像差和散射的自我补偿能力，以达到样品内部的稳定超分辨成像的实现方法。

本发明的一个目的在于提供一种基于一阶贝塞尔光束的受激辐射损耗超分辨显微镜。

本发明的基于一阶贝塞尔光束的受激辐射损耗超分辨显微镜包括：激发光光源、损耗光光源、激发光扩束准直系统、损耗光扩束准直系统、螺旋形相位板、贝塞尔光束产生系统、损耗光聚焦透镜、合束系统、物镜、压电扫描系统、滤波片、信号收集系统和单光子探测器；其中，激发光光源输出的激发光经过激发光扩束准直系统后充满物镜的入瞳；损耗光光源输出的线偏振的损耗光依次经过扩束准直系统、螺旋形相位板、贝塞尔光束产生系统和损耗光聚焦透镜，通过合束系统和激发光精确合束后，再由物镜聚焦到样品上；样品放置在压电扫描系统上，通过压电扫描系统扫描样品，样品产生的信号光通过信号收集系统进入单光子探测器，从而得到样品的超分辨图像；损耗光聚焦透镜与物镜满足共焦条件，构成共焦系统，经贝塞尔光束产生系统产生的一阶贝塞尔光束，通过损耗光聚焦透镜和物镜聚焦后，形成的聚焦光斑为轴向的线光；激发光在物镜后形成的聚焦光斑为点光，通过调节贝塞尔光束产生系统与损耗光聚焦透镜之间的距离，使得激发光的聚焦光斑的点光的中心位于贝塞尔光束的聚焦光斑的线光的轴向中心，并且通过调节合束系统使损耗光与激发光的聚焦光斑的横向精确重合。

损耗光聚焦透镜与物镜满足共焦条件，构成共焦系统，在损耗光聚焦透镜的后焦点位于物镜的前焦点附近，调节损耗光聚焦透镜与物镜之间的距离，使得形成的聚焦光斑的轴向最长。

贝塞尔光束产生系统采用角锥镜，通过调节角锥镜和损耗光聚焦透镜之间的距离，使得激发光在物镜后形成的点光的中心位于贝塞尔光束的线光的轴向中心；角锥镜的顶角越大，物镜后一阶贝塞尔光束的线光的轴向长度越长。或者，贝塞尔光束产生系统采用环形模板和一个准直透镜，这种配置下要求环形模板在准直透镜的前焦面处，通过调节准直透镜与损耗光聚焦透镜之间的距离，使得激发光在物镜后形成的点光的中心位于贝塞尔光束的线光的轴向中心；环形模板包括一个透光的圆环和其余不透光的底板，其中透光的圆环的宽度与经物镜聚焦后产生的线光的轴向长度有关，环的宽度越宽，线光的长度越长。或者，贝塞尔光束产生系统采用空间光调制器，通过调节空间光调制器和损耗光聚焦透镜之间的距离使激发光在物镜后形成的点光的中心位于贝塞尔光束的线光的轴向中心。