[发明专利]一种内切型β-琼胶酶及其制备方法

说明书

一种内切型β‑琼胶酶及其制备方法，涉及琼胶酶。提取Flammeovirga sp.SJP92基因组DNA，通过PCR扩增获得了琼胶酶rAgaA的核苷酸序列，并鉴定了该核苷酸序列agaA。通过穿梭质粒pHT43构建了重组质粒pHT43‑AgaA，在枯草芽孢杆菌WB800N中进行重组蛋白的表达。纯化后的蛋白纯度高，活力好，为其实际应用提供了基础。通过同源重组表达β‑琼胶酶，可以克服分离纯化过程复杂繁琐、产量低等不足，为该蛋白能广泛应用于生物、食品、医药、农业等领域奠定基础。

技术领域

本发明涉及琼胶酶，尤其是涉及一种内切型β-琼胶酶及其制备方法。

背景技术

琼胶是一种为人所熟知的海洋性多糖，由含量较高、分子量较大、硫酸基较少的琼脂糖以及含量较少、分子量较小、硫酸基和其它取代基团较多、成分较复杂的琼脂胶组成。无论是琼脂糖或者琼脂胶，它们的多糖链都是由(1-3)-β-D-半乳糖和(1-4)-3、6-内醚-α-L-半乳糖通过α-1,3和β-1,4糖苷键相互交替连接而成。只是琼脂胶多糖链上的(1-4)-3、6-内醚-α-L-半乳糖的羟基被硫酸基、甲氧基、丙酮酸等基团取代。

琼胶酶是一类能够水解琼脂糖的糖苷酶。根据水解方式的不同，可以分为α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶可以破坏琼脂糖的α-1，3糖苷键生成以3、6-内醚-α-L-半乳糖为还原末端的琼胶寡糖系列，而β琼胶酶可以降解琼脂糖的β-1，4糖苷键，生成以β-D-半乳糖为还原末端的新琼胶寡糖系列。

琼胶酶在科学研究、食品与医疗保健等领域具有广泛的应用。它可用于DNA回收、藻类原生质体的制备、藻类单细胞的制备等领域。随着海藻寡糖研究的兴起与深入，越来越多的研究证明，琼胶寡糖具有多种生理功能，例如抗癌、抗炎、抗氧化、美白、增加肠道益生菌等。与传统的酸碱制备法相比，琼胶酶酶解法高效、温和、低耗、产物稳定，是制备琼胶寡糖的首选方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种内切型β-琼胶酶基因的核苷酸序列；

本发明的第二个目的是提供一种内切型β-琼胶酶蛋白质的氨基酸序列；

本发明的第三个目的是提供一种内切型β-琼胶酶的制备方法；

本发明的第四个目的是提供一种内切型β-琼胶酶的酶学特征。

Flammeovirga sp.SJP92β-琼胶酶已于2014年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10071。

本发明所述内切型β-琼胶酶基因，其编码的核苷酸序列记为agaA。

所述内切型β-琼胶酶基因，其特征在于所述β-琼胶酶基因agaA的分子类型为DNA，序列特征：长度为1515bp，类型为核苷酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所述内切型β-琼胶酶基因的序列如下所示，记为SEQ ID No.1：

本发明所述内切型β-琼胶酶基因，其核苷酸序列采用以下方法获得：提取Flammeovirga sp.SJP92的总DNA，以合成序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.4作为引物，经PCR扩增获得agaA基因核苷酸序列SEQ ID No.1。agaA基因相关的核苷酸序列SEQ ID No.1通过基因预测获得基因编码的多肽SEQ ID No.2序列。然后通过枯草芽孢杆菌WB800N表达agaA基因，纯化agaA基因的表达产物，并通过生物学方法证明agaA基因编码的多肽SEQ ID No.2(不含信号肽)具有琼胶酶活性；

本发明所述内切型β-琼胶酶包括具有降解琼脂糖活性的β-琼胶酶rAgaA。