[发明专利]一种实时监测G-四联体形成的单颗粒SPR钾离子探针的方法

说明书

本发明提供了一种实时监测G‑四联体形成的单颗粒SPR探针的制备和应用。基于贵金属(金、银等)纳米颗粒的良好的生物相容性、大比表面积和SPR高灵敏性，采用可与钾离子特异结合的端粒Aptamer对贵金属纳米颗粒进行表面修饰，简单、方便的构建了可高灵敏检测钾离子并实时监测G‑四联体形成过程的单颗粒生物探针。特异性结合的整个过程可以通过暗场显微镜(DFM)和散射光谱仪联用下的单个贵金属纳米颗粒的SPR光谱峰移动量来表征。此探针具有实时检测的功能，且检测速度快，灵敏度高，检测范围宽等优点。此外，可通过数据拟合分析得到形成G‑四联体的解离常数K_d和吉布斯自由能ΔG，以及在形成过程中的两种结合位点形态。

本发明具体涉及一种可高灵敏检测钾离子、并实时监测G-四联体形成过程的方法，属于纳米材料生物应用领域。

背景技术

贵金属(金和银等)纳米颗粒在入射光照射下，界面的自由电子和光子发生共振运动形成等离子体共振效应。当金属纳米颗粒直径大于或近似于自由电子的平均自由程时，颗粒受激后将产生明显的散射现象，由于该现象主要发生在表面，因此被称为表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)散射。研究发现，其散射光谱主要依赖于纳米颗粒的形状、大小以及颗粒和其周围环境的介电常数。纳米颗粒的形貌和尺寸的不同，将引起表面自由电子密度、电子震荡频率的变化，从而造成包括吸收和散射光学性质的变化。基于的SPR散射本身独特的光学性质，对基于SPR散射的纳米结构体系的研究已成为迅猛发展的热点研究领域之一，即表面等离子体光子学。表面等离子体光子学包含非常广泛的研究内容,例如表面电场增强光谱、表面增强拉曼光谱、表面等离子体纳米波导、表面等离子体光催化、表面增强的能量转移及选择性光吸收等，尤其是表面等离子共振生物传感已经成为重要的分支之一，该方法是在单颗粒上实现单分子水平检测的有效手段。目前基于纳米等离子体界面微环境的折射率变化、生物分子分布以及纳米颗粒间或复合物颗粒核-壳间强烈的耦合作用，并结合暗场显微镜与光谱仪的优势，可以在纳米尺度开发出具有极高灵敏度的单分子水平的生物探针、新型的生物成像试剂或治疗试剂。

G-四联体是一种特殊的核酸二级结构，广泛存在于人类基因组DNA以及RNA中，如DNA的端粒序列、基因的启动子序列、RNA的5'端非翻译区(5'UTR)序列等。许多研究发现，G-四联体结构在基因的稳定性、端粒合成过程、基因转录和翻译水平的表达调控、基因重组等生命过程中起着至关重要的作用。富含鸟苷酸的DNA或者RNA在单价阳离子，如Na⁺、K⁺、NH₄⁺、Rb⁺等存在的条件下，均能形成稳定的G-四联体二级结构。4个鸟嘌呤碱基通过氢键的配对方式形成G-4平面，适当的阳离子可以使多个G-4平面堆叠形成G-四联体结构。阳离子中体积最适合嵌入G-四联体结构的是K⁺，K⁺对G-四联体的稳定作用最为显著，而真核细胞内往往具有相对较高的钾离子浓度，因而提示在细胞内的钾离子作用下，有利于G-四联体的形成，并发挥生物学效应。

目前，检测钾离子的方法有很多，例如：荧光法、电化学法、比色法等，但是这些检测方法所依据的探针因为尺寸和灵敏度的问题，在应用中有很大的局限性。

发明内容

为了得到高灵敏的小尺寸钾离子探针，本发明设计了基于单个贵金属纳米颗粒的SPR探针，实现了高灵敏检测钾离子并实时监测G-四联体形成过程的功能，此SPR探针的测定过程的实现了无标记，检测速度快，灵敏度高，检测范围宽等优点。

制备过程如下：

1、一种实时监测G-四联体形成的单颗粒SPR探针的制备

首先，用种子生长法合成≈50nm的金纳米颗粒，采用如下方法制备:

步骤1.合成颗粒

(1)种子合成